Perpustakaan Digital ITB

Lipase merupakan salah satu enzim komersil yang banyak digunakan dalam berbagai bidang industri sebagai biokatalis. Produksi lipase dalam jumlah yang tinggi sangat diperlukan untuk memenuhi kebutuhan industri. Pada penelitian sebelumnya, gen lipase termostabil LK2 yang diisolasi dari kompos telah diklon ke dalam vektor ekspresi pET-30a(+) dan telah dieskpresikan dalam £..,chenchiu coli BL2l (DE3) secara intraseluler. Namun, lipase yang dihasilkan masih membentuk badan inklusi sehingga mempunyai aktivitas yang relatif rendah. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan lipase dalam bentuk yang terla rut dengan mengekspresikan gen lipase LK2 dalam P1chw pas/(ms GS115 secara ekstrasel uler. Plasm id rekombinan pPICZaA-LK2 diperoleh dengan memindahkan gen lipase termostabil !X2 dari vektor pET-30a(+) ke pPICZa A. Gen tersebut diamplifikasi menggunakan PCR dengan template plasmid rekombinan pET30a(+)-LK2 dari penelitian sebelum nya. Amplikon gen LK2 kemudian diligasikan ke vek.1or pGEM-T / 'asy sehingga diperoleh plasmid rekombinan pGEMT-LK2. Plasmid rekombinan pGEMT-LK2 dipotong dengan enzim restriksi EcoRl dan Xhal sehingga diperoleh gen lipase LK2 yang akan diligasikan ke shuttle vektor pPICZa A. Plasmid rekombinan pPICZaA-LK2 kemudian diperbanyak dalam Escherichia coli TOPl OF' dan diisolasi dengan metode !isis alkali. Plasmid rekombinan pPICZaA-LK2 yang diisolasi dari Escherichw coli TOPl OF' dilinearisasi dengan enzim restriksi Sucl. Pichiu paston'i GS115 kemudian ditransformasi dengan plasmid rekombinan linier menggunakan metode elektroporasi. Plasmid rekombinan tersebut terintegrasi ke genom ragi melalui rekombinasi homolog sehingga diperoleh transforman ragi yang membawa gen lipase JJK2. Selanjutnya, gen lipase termostabil LK2 diekspresikan dalam P1chia pustoris dan di induksi dengan penambahan metanol per 24 jam selama 5 hari. Supernatan lipase LK2 hasil ekspresi dianalisis dengan uji aktivitas hidrolisis menggunakan substrat p-nitrofenollaurat dan SDS-PAGE (elektroforesis gel akrilamida-natrium dodesil sulfat). Sebelum dilakukan ekspresi gen dalam skala besar, optimasi transforman dan optimasi metanol dilakukan terlebih dahulu. Hasil uji aktivitas supernatan dari beberapa transforman menunjukkan bahwa transforman 3 (Mut) memiliki aktivitas spesifik yang paling tinggi, yaitu 0,06529 U/mg. Hasil uji aktivitas supematan untuk optimasi metanol menunjukkan bahwa aktivitas spesiftk tertinggi diperoleh pada hari induksi ke-5 dengan penambahan I 0 o metanol per 24 jam. Elektroforegram SDS-PAGE supematan lipase LK2 dari beberapa transfom1an menunjukkan satu pita tebal berukuran sekitar 35 kDa. Ukuran pita protein tersebut sesuai dengan berat molekul lipase LK2 secara teoriti s (35,7 kDa) sehingga pita protein tersebut dapat di simpulkan sebagai lipase LK2 yang telah terekspresi dalam P. pu.\lons.