Perpustakaan Digital ITB

Diabetes merupakan pen) akit gangguan metabolisme kronis ) ang ditandai dengan tinggin) a kadar gula darah yang disertai dengan gangguan metabolisme sebagai akibat insuftsiensi fung:.i in:,ulin. Salah :,alu jeni:, in:,ulin analog rekombinan yang bt::.ifal rapidr actin:.; mw/;>XW! adalah insulin aspart. Tujuan pcnclitian ini adalah untuk mcngkonstruksi ragi Pichia pwtoris X-33 )ang membawa gen prekursor insuli n aspart rei-.ornbinan (Asp[) dan men gopt imasi produksi prekursor insu lin aspart rekornbinan pada P. pasroris X-33 dengan menggunakan Respunse Sw:fa< e ,\lethodt>lof!J (RSM). P. pu.lluris X-33 ditran:.fonnasi dengan pia mid pPICZaA-Asp/ :rang mengkodc polipeptida )ang terdiri dari 58 rcsidu asarn am i no dengan met ode clektroporasi. Transfonnan P. pas/oris X-33 ) ang membav.-a banyak kopi gen . hp/ di:.ekbi pada medium pcrtumbuhan YPD ( Yeml extrucl-Peptvne-Dexlro.\e) :ang mengandung Zeocin 500 Jlg/mL. I .000 tg/mL. 1 .500 tg/mL. dan 2.000 tg/mL. Di dapat 49 i,.olon1 akhir )ang tumbuh dari -l9 koloni ya ng diseleksi. Fragmen DNA berukuran 638 pasang ba!>a )an g didapat dati Foflmeri:: .d Chuin Ri!adion (PCR) 1-.ol oni yang menunjul-.1-.an ul-.uran gen prekurosor insulin aspart rekombinan. 25 koloni telah dikonfirmasi mengandung gcn Asp/ dengan genotipe Mut . Analisis ckspresi SDS-PAGE dari koioni 3. 15. 34. 50. dan 51 mcnunjul-.l,.an l,.oloni 3-l adalah l,.oloni yang m cmili ki pita prckursor insulin aspart rcl-.ombinan )ang optimum. Lama induksi metan ol 3% {v / v) optimum dalam produksi prekursor insulin aspart rckombinan pada P. powori1 X-33-Aspl-34 adalah 72 jam. Koloni P. pmroris X-33- .isp f-3dioptirnasi l,.ondi si produksin)a pada medb ekspresi Buffered ,\fcrlwnol-complcx Medium (BMMY) mcnggunakan RSM dengan Central Composite De\. ign (CCD) empat le\el. Ko lon i P. { )(L\•toris X-33-Aspf-3-l diinkubasi Jcngan menggunakan labu dengan pengocokan :,e lama T2 jam. Parameter }ang digunakan untuk mengoptimasi kondisi produl,.si adalah !..onscntrasi induksi metanol. ODotJO 3\\al. perbandingan aerasi. dan pi I medium pert umbuhan. C"-prcsi prekursor insulin aspart rel,.ombinan dianalisis dengan menggunat...an SDS-PAGE dan dil,.uantifih.asi dcngan menggunal,.an den-.itometer untul,. mengetahui klm.entrai prekur'or in sulin aspart) ang dihasilkan. Kadar prel,.ursor insulin aspart yang didapat digunakan scbaga i rcc;pons dari RSM dan diana!isis dcngan mcnggunakan pcrangkat lunak Minitab l8. L3erdasarkan hasil analisis optimasi mengguna!..an RSM. kondisi produks1 optim um untul,. cl,.prei prekursor insul in aspart rekombinan pada P. pastoris X-33 adalah pH 6.3. konsentrasi metanol 3%, 00600 a\\al 50. dan perbandingan aerasi sebesar 8 mL/1 00 mL.