Perpustakaan Digital ITB

-Amilase (EC 3.2.1.1) merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan ?- 1,4-glikosidik pada pati menghasilkan oligosakarida berantai lurus dan bercabang. Pada industri pengolahan pati, konversi pati menjadi oligosakarida umumnya menggunakan ?-amilase termostabil. ?-Amilase hipertemostabil Pyrococcus furiosus (PFA) mempunyai kemampuan untuk bekerja pada suhu tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk memurnikan dan mengkarakterisasi PFA rekombinan yang diekspresikan pada Pichia pastoris KM71. Penelitian ini dilakukan beberapa tahap, yaitu transformasi P. pastoris KM71 dengan pPICZ?A- PFA, optimasi waktu inkubasi dan konsentrasi penginduksi metanol untuk produksi PFA, pemurnian PFA dengan kromatografi afinitas Co-NTA dalam keadaan enzim terdenaturasi dan karakterisasi PFA murni. Plasmid pPICZ?A-PFA rekombinan diintegrasikan ke dalam kromosom P. pastoris KM71 melalui rekombinasi homolog single cross-over. Gen PFA yang telah terintegrasi dalam kromosom P. pastoris KM71 dikonfirmasi dengan koloni PCR yang ditandai dengan adanya fragmen DNA dengan ukuran 1,7 kb pada analisis gel agarosa. Selanjutnya, transforman P. pastoris KM71 ditumbuhkan pada media yang mengandung zeosin konsentrasi tinggi (2000 mg/mL) untuk seleksi integrasi jumlah salinan gen yang banyak. Pada konstruk ini, gen PFA diregulasi oleh promotor AOX1 dan urutan pengkodenya difusi dengan oligonukleotida untuk peptida sinyal pre-pro-? factor. Oleh karena itu, ekspresi PFA membutuhkan metanol sebagai penginduksi dan PFA akan disekresikan ke dalam media. Ekspresi PFA pada transforman P. pastoris KM71 yang mampu hidup pada media dengan zeosin konsentrasi tinggi diinduksi oleh penambahan metanol pada temperatur 30 oC. Konsentrasi metanol optimum diperoleh pada konsentrasi 3% selama 120 jam. Analisis SDS-PAGE dan analisis zimogram menunjukkan berat molekul PFA sebesar ~56 kDa. Ekstrak kasar enzim dipekatkan dengan ultrafiltrasi, dan kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas Co-NTA dalam keadaan enzim terdenaturasi. PFA dapat menghidrolisis pati terlarut dengan aktivitas sebesar 1,8x105 U/mg yang diukur menggunakan metode asam dinitrosalisilat (DNS). Kemurnian PFA meningkat sebesar 63 kali dan PFA murni memiliki aktivitas optimum pada pH 5,0 dan temperatur 90 oC.