Perpustakaan Digital ITB

Dengue merupakan penyakit epidemik yang disebabkan oleh virus pada daerah tropis dan subtropis di mana Indonesia sebagai negara dengan kasus demam dengue tertinggi di Asia Tenggara. Obat dan vaksin berlisensi masih belum ditemukan untuk penyakit dengue, sehingga diagnosis awal sangat diperlukan untuk penanganan awal penderita yang terinfeksi dengue. Pada saat ini, beberapa kit diagnostik komersial tersedia tetapi masih diimpor namun kit dikembangkan menggunakan urutan nukleotida virus dengue galur asing. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi dan memurnikan protein rekombinan NS1 DENV-3 dengan urutan nukleotida virus dengue galur Indonesia. Plasmid rekombinan pPICZ?A- DENV3-NS1 yang membawa gen sintetik pengkode protein NS1 dari virus dengue serotipe 3 (DENV-3) yang digunakan untuk transformasi Pichia pastoris KM71. Gen DENV3-NS1 disisipkan diantara promotor AOX1 dan terminator transkripsi AOX1. Gen DENV3-NS1 pada plasmid diintegrasikan ke dalam kromosom P. pastoris melalui rekombinasi homolog single cross over pada lokus AOX1. Transforman P. pastoris yang membawa NS1 DENV-3 diseleksi dengan menggunakan PCR koloni dengan pasangan primer AOX1. Pada plasmid rekombinan ini, urutan nukleotida pengkode NS1 DENV-3 difusikan dengan oligonukleotida pengkode peptida sinyal faktor pre-pro-? untuk menghasilkan NS1 DENV-3 yang dapat disekresikan ke dalam media. Ekspresi NS1 DENV-3 diinduksi dengan metanol 3% (v/v) selama 72 jam pada suhu 30 oC. Keberadaan protein rekombinan NS1 DENV-3 dalam medium dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE. NS1 DENV-3 ditemukan sebagai protein ekstraseluler dengan massa molekul sekitar 43 kDa, dan menariknya protein juga ditemukan secara intraseluler. Selanjutnya, kedua protein ekstraseluler dan intraseluler NS1 DENV-3 dimurnikan dengan menggunakan metode kromatografi afinitas Ni-NTA dengan hasil pemurnian sebesar 0,7 mg/L dan 16,1 mg/L BMMY medium. Protein murni NS1 DENV-3 memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan antibodi monoklonal anti NS1 pada kit diagnostik komersial Dengue ICT strip, sehingga NS1 DENV-3 dapat digunakan untuk pengembangan kit diagnostik dengue.