Perpustakaan Digital ITB

Kitosan merupakan polimer dari ?-1,4-D-glukosamin yang memiliki beberapa bioaktivitas, seperti fungistatik, antitumor, dan antikolesterol. Polimer ini merupakan hasil deasetilasi kitin (poli-?-1,4-N-asetil-D-glukosamin) yang diisolasi dari cangkang makhluk hidup Crustacea. Akan tetapi, pemanfaatan kitosan terbatas karena kelarutannya rendah dan viskositasnya tinggi. Namun, kitosanase dapat menghidrolisis kitosan menjadi kitooligosakarida yang memiliki kelarutan yang lebih tinggi sehingga dapat diaplikasikan dalam skala yang lebih luas. Gen kitosanase (csn1) dari bakteri laut Bacillus amyloliquefaciens ABBD telah diisolasi sebelumnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkonstruksi plasmid rekombinan pPICZ?-A yang mengandung gen csn1 yang digabungkan dengan oligonukleotida signal sequence MF? dan diregulasi oleh promotor AOX1 dari Pichia pastoris. Amplifikasi gen csn1 dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan kromosom Bacillus amyloliquefaciens ABBD sebagai templat dan satu set primer yang dirancang berdasarkan urutan nukleotida csn1 yang telah dipublikasi (GenBank AGT20518.1). Fragmen DNA hasil PCR dengan ukuran 737 pasang basa (pb) diligasi ke dalam pGEM-T. Plasmid rekombinan pGEMT-csn1 kemudian diverifikasi dengan analisis urutan nukleotida dan ditemukan bahwa csn1 memiliki dua mutasi titik dibandingkan dengan urutan csn1 acuan. Plasmid rekombinan pGEMT-csn1 kemudian dipotong dengan enzim restriksi EcoRI dan XbaI, dan fragmen DNA csn1/EcoRI-XbaI diligasi ke dalam pPICZ?-A yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama. pPICZ?A-csn1 telah dikonfirmasi menggunakan analisis restriksi dan analisis urutan nukleotida. Oleh karena itu, plasmid rekombinan pPICZ?A-csn1 yang telah dikonstruksi dalam penelitian ini dapat digunakan untuk produksi protein kitosanase rekombinan dalam P. pastoris di masa depan.