Perpustakaan Digital ITB

-Amilase (?-1,4-glukan 4 glucanohydrolase, EC 3.2.1.1) adalah endoenzim yang dapat menghidrolisis ikatan -1,4 glikosidik pada polisakarida menghasilkan oligosakarida, dekstrin, dan sejumlah kecil glukosa. ?-Amilase Pyrococcus furiosus (Pfa) merupakan ?-amilase hipertermostabil dihasilkan archae obligat anaerob P. furiosus. Stabilitas termal Pfa pada suhu tinggi membuatnya berpotensi sebagai enzim penghidrolisis pati pada tahap likuifasi di industri pengolahan pati. Produksi ?-amilase komersial memerlukan perlukan sistem inang ekspresi dengan level ekspresi yang tinggi dan efisien. Ragi metilotropik, Pichia pastoris merupakan sistem ekspresi gen heterolog intrasel ataupun ekstrasel dengan level ekspresi protein heterolog yang tinggi. P. pastoris banyak digunakan sebagai sistem ekspresi protein heterolog karena memiliki beberapa alasan, antara lain mampu tumbuh hingga mencapai densitas sel yang tinggi, penggunaan promotor kuat AOX1, integrasi gen target pada kromoson inang, media pertumbuhan yang murah, dan efisien ekspresi yang tinggi. Ekspresi protein heterolog selain dipengaruhi oleh sel inang dan vektor ekspresi, juga dipengaruhi oleh kesesuaian kodon bias gen target dengan kodon bias sel inang. Upaya untuk meningkatkan ekspresi protein rekombinan dapat dilakukan dengan mengubah kodon referensi pada gen target dengan kodon bias sel inang dan menggunakan kodon pada gen target dengan kandungan GC yang serupa dengan kandungan GC genom sel inang. Korelasi kodon bias suatu gen dengan tingkat ekspresinya ditentukan dengan indeks adaptasi kodon (codon adaptation index, CIA). Nilai CAI yang tinggi menggambarkan tingkat level ekspresi protein rekombinan yang tinggi pada sel inang. Tujuan penelitian ini adalah merancang gen sintetik ?-amilase termostabil Pyrococcus furiosus (pfasyn) dan mempelajari ekspresikannya pada ragi metilotropik P. pastoris. Gen -amilase P. furiosus (pfasyn) dikonstruksi berdasarkan urutan asam amino -amilase hipertermostabil P. furiosus DSM 3638 (Ac. No. P49067) dalam plasmid pPICZ?A. Optimasi sintesis gen pfa dilakukan dengan pemilihan nilai indeks adaptasi kodon sebesar 0,905 dan nilai kandungan GC sebesar 44,7 % sesuai dengan kodon optimal P. pastoris. Gen pfasyn disintesis oleh 1st base Introduksi plasmid rekombinan pPICZ?A-pfasyn pada P. pastoris KM71H berfenotip Muts dan GS115 berfenotip Mut+ menghasilkan transforman yang memiliki aktivitas ?-amilase. Ekspresi Pfa pada P. pastoris diregulasi oleh promotor kuat AOX1 dan sebagai signal sekresi protein digunakan mating factor ? (MF-?) dari S. cerevisiae yang terdapat pada vektor ekspresi pPICZ?A. Level ekspresi Pfa pada P. pastoris GS115 lebih tinggi dibandingkan P. pastoris KM71H. Karakterisasi ekstrak kasar Pfa dari P. pastoris GS115 menunjukkan bahwa Pfa memiliki aktivitas amilolitik optimum pada suhu 90 ºC dan pH 5,0. Inkubasi pada suhu 80 dan 90 0C selama 240 menit tidak menurunkan aktivitas amilotik Pfa, namun aktivitas amilolitik Pfa menurun sebesar 25% setelah diinkubasi selama 240 menit pada suhu 100 oC. Analisis kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa produk hidrolisis pati oleh Pfa berupa maltotriosa, maltosa dan sedikit glukosa.