Perpustakaan Digital ITB

Riset yang berhubungan dengan analisis DNA dan aplikasinya dalam berbagai bidang ilmu pengetahuan dan teknologi merupakan cabang ilmu terdepan karena banyak membantu menjawab persoalan-persoalan dasar manusia di masa kini dan akan datang. Sifat kehipervariabelitasan mtDNA selama ini dihubungkan dengan perbandingan urutan dan mutasi nukleotida mtDNA antarindividu, etnis/suku dan usia. Namun demikian, hipervariabelitas mutasi yang terjadi pada mtG terhadap rCRS (revised-Cambridge Reference Sequence) dan hipervariabelitas mtG pada berbagai jaringan yang asal-usulnya berbeda misalnya lapisan entoderm, mesoderm, dan ektoderm pada individu tertentu belum ada yang melaporkan. Selain itu, akan dibandingkan mutasi nukleotida pada daerah-daerah pengode gen mtG serta dilihat mutasi baru atau mutasi yang belum dilaporkan. Pada disertasi ini urutan nukleotida mtG yang berasal dari dua individu manusia Indonesia, yang belum pernah dilaporkan sebelumnya, telah berhasil disekuen urutan nukleotidanya yang diperoleh melalui protokol DNA purification from tissues dan Repli-G. Perancangan primer dilakukan untuk mengamplifikasi 10 fragmen mtG (fragment A, B, C, D, E, F, G, H, I, dan M) dengan memperhatikan aspek keefisienannya. Analisis mutasi dilakukan dengan menggunakan aneka program pengolah data seperti DNASTAR: Seqman, MegAlign, Editseq; H-Man; Program Spreadsheet Excell v.3 dan v.4. Hasil analisis mutasi menunjukkan adanya mutasi titik pada hampir semua fragmen mtG dengan proporsi yang berbeda. Mutasi nukleotida antarjaringan dalam satu individu menunjukkan pola yang sama baik pada daerah D-loop (control region) maupun pada daerah pengkode gen (coding region). Hal ini menunjukkan bahwa mutasi yang terjadi pada satu individu adalah bersifat monomorfik. Varian mutasi yang terjadi pada mtG manusia individu A yang dibandingkan dengan rCRS adalah sebagai berikut. Dua varian pada 12S rRNA, satu varian 16S rRNA, satu varian pada daerah ND1, dua varian pada daerah ND2, satu varian pada daerah inter-region (int), tiga varian pada daerah CO1, satu varian pada daerah CO2, lima varian pada daerah ATP6, satu varian daerah CO3, dua varian pada daerah ND3, dua varian pada daerah ND4, tiga varian pada daerah ND5, dua varian pada daerah CYB, dan lima varian pada daerah D-loop. Untuk individu B, varian mutasi meliputi satu varian pada daerah 12S rRNA, satu varian pada daerah 16S rRNA, satu varian pada daerah ND1, satu varian pada daerah ND2, satu varian pada daerah int, satu varian pada daerah CO2, satu varian pada daerah ATP6, satu varian pada daerah CO3, satu varian pada daerah ND3, dua varian pada daerah ND4, dua varian pada daerah ND5, tiga varian pada daerah CYB, dan enam varian pada daerah D-loop. Selain itu, dari hasil penelitian ini juga didapat sembilan varian mutasi yang belum pernah dilaporkan di MITOMAP dari hasil sekuen manusia Indonesia. Varian mutasi yang belum pernah dilaporkan tersebut adalah T650c, A3873g, C5213g, A6863g, A7894g, A8652g, A8653g, G10373c, dan C15211t. Jenis mutasi terbanyak yang terjadi pada mtG adalah mutasi substitusi transisi. Varian mutasi yang menunjukkan perbedaan terhadap rCRS adalah pada daerah-daerah seperti D-loop, rRNA, ND2, CO1, ATP6, ND3, ND4, ND5, CYB. Analisis ukuran variasi nukleotida manusia dari data GenBank terhadap rCRS disusun untuk mengukur ukuran atau besarnya mtG manusia. Ukuran mtG yang dianalisis berkisar antara 16558-16574 pb dari 301 sampel GenBank tersebut. Ukuran mtG terbanyak sesuai dengan panjang pasang basa yang diusulkan pertama kali oleh Anderson dan koleganya maupun oleh Andrews dan koleganya menurut versi revisi, yakni 16569 pb, sebanyak 113 sampel. Jumlah pasang basa terbanyak berikutnya berturut-turut, ukuran 16570 pb (97 sampel), 16571 pb (44 sampel), 16572 pb (10 sampel), 16574 pb (3 sampel), 16573 pb (2 sampel), 16558 pb dan 16559 pb (masing-masing 1 sampel). Hal ini dilakukan untuk mengamati tingkat mutasi pada urutan nukleotida mtG manusia tiap individu, karena telah diketahui sebelumnya bahwa tingkat mutasi yang terjadi pada mtG berbeda-beda tiap individu yang tidak segaris keturunan ibu. Jumlah varian nukleotida (mutasi terhadap rCRS) pada tiap sampel ternyata berkisar antara 12 (jumlah mutasi yang terkecil) sampai hingga 42 (jumlah mutasi yang terbesar) dari total 301 sampel mtG manusia yang berasal dari GenBank. Jumlah mutasi terbanyak adalah 15 varian mutasi yang ditemukan pada 42 individu atau 13,95 %. Lima jumlah mutasi terbanyak berikutnya berturut-turut 17 varian mutasi (39 individu atau 12,95 %), 16 varian mutasi (37 individu atau 12,29 %), 18 varian mutasi (36 individu atau 11,96 %), 14 varian mutasi (20 individu atau 6,64 %), dan 19 varian mutasi (18 individu atau 5,96 %). Selanjutnya, jumlah individu-individu data GenBank yang mengalami mutasi paling sedikit, yakni satu individu atau 0,33 % adalah dengan jumlah varian 26, 27, 31,32, 34, 37, 40, dan 42. Data jumlah varian mutasi terbanyak adalah 42 varian atau hanya 0,25 % dari total nukleotida mtG manusia. Data varian mutasi dari 14 sampel pada beberapa etnis terhadap 163 posisi nukleotida menunjukkan profil distribusi mutasi yang tersebar secara tidak merata atau dengan proporsi mutasi yang berbeda tiap daerah mtG. Dengan kata lain, terdapat daerah dengan jumlah proporsi mutasi tinggi dan ada daerah dengan jumlah proporsi mutasi yang rendah. Pada masing-masing daerah yang dibagi menjadi 1000 nukleotida, ditemukan jumlah mutasi di bawah 18 persen pada setiap jarak 1000 nukleotida. Posisi basa nukleotida 1000-3000, 6000-8000, dan 9000-10000 adalah daerah yang paling kecil terjadinya mutasi, yaitu kurang dari 4 persen dari tiap jarak 1000 nukleotida. Sementara itu, daerah dengan tingkat mutasi paling tinggi adalah posisi basa nukleotida 1-1000 dan 16.000-16.569, dengan persentase masing-masing di atas 10 persen, yakni 12,88 persen dan 17,17 persen. Dari hasil riset di atas, alur penelitian dan pengembangan baru yang dapat dihasilkan dari penelitian ini adalah melakukan studi lanjutan isolasi dan amplifikasi keseluruhan mtG sehingga dapat dikembangkan metode amplifikasi mtG yang lebih murah dan efisien. Penelitian lain yang dapat dikembangkan adalah studi untuk menentukan mutasi baru (yang belum dilaporkan di MITOMAP), terutama yang berhubungan dengan pengungkapan varian mutasi pada daerah pengode gen dan ekspresi biokimia yang terjadi serta manifestasi klinisnya pada penyakit mitokondria. Dengan membuat basis data mutasi yang berhubungan dengan penyakit tertentu memungkinkan lebih cepat menentukan status penyakit seseorang. Di samping itu pendekatan yang dilakukan pada penelitian ini dapat dijadikan acuan dalam pengkajian mutasi-mutasi lain yang diduga berhubungan dengan penyakit mitokondria terutama untuk manusia Indonesia dari berbagai suku.