Perpustakaan Digital ITB

Senyawa organohalogen adalah senyawa organik yang secara luas telah digunakan sebagai herbisida, insektisida, bahan pembuat plastik, dan pelarut organik dalam berbagai industri. Senyawa ini dapat menyebabkan pencemaran lingkungan karena bersifat toksik, persisten, dan bisa bertransformasi menjadi metabolit yang berbahaya. Selain itu, senyawa ini bisa tersebar dimana-mana, meresap ke dalam tanah, terakumulasi pada air tanah, dan berpotensi menyebabkan polusi jangka panjang. Dalam jangka panjang senyawa organohalogen dapat menyebabkan gangguan fungsi ginjal, hati, sistem syaraf, kekebalan tubuh dan menyebabkan kanker. Beberapa mikroorganisme yang memiliki enzim dehalogenase bisa memetabolisme senyawa organohalogen dan mengubahnya menjadi senyawa metabolit yang tidak berbahaya. Oleh karena itu, mikroorganisme ini sangat potensial digunakan untuk mengatasi polutan organohalogen di lingkungan. Namun enzim dehalogenase umumnya diekspresikan dalam jumlah sedikit, sehingga tidak efisien dalam mengurangi polutan. Adanya perkembangan di bidang teknologi molekular, seperti teknik DNA rekombinan, telah memberikan solusi terhadap persoalan ini. Produksi sejumlah enzim potensial dalam jumlah banyak telah dapat dilakukan melalui pemanfaatan teknik DNA rekombinan. Teknik ini dilakukan dengan mengidentifikasi gen pengkode enzim yang diinginkan dari mikroba potensial dan mengekspresikan gen tersebut pada sistem ekspresi baru dengan kemampuan ekspresi yang lebih tinggi. Pada penelitian sebelumnya telah berhasil dilakukan isolasi dan karakterisasi gen haloacid dehalogenase dari bakteri Bacillus cereus strain lokal yang diperoleh dari Balitbang Pertanian RI. Gen tersebut diberi nama gen bcfd1 dan telah diklon ke vektor kloning pGEM-T dalam sel inang E. coli TOP10. Penelitian ini bertujuan untuk sub kloning gen bcfd1 tersebut ke vektor ekspresi pET-30a dan menganalisis ekspresinya pada E. coli BL21 (DE3). Penelitian diawali dengan perancangan primer spesifik untuk amplifikasi gen bcfd1 pengkode haloacid dehalogenase dari Bacillus cereus strain lokal dengan penambahan sisi pemotongan enzim restriksi EcoRI dan HindIII untuk mendapatkan arah kloning yang benar. Tahap amplifikasi gen bcfd1 dilakukan dengan PCR menggunakan kromosom Bacillus cereus strain lokal sebagai templat. Fragmen DNA hasil amplifikasi terlebih dahulu diklon ke vektor kloning pGEMT-Easy, kemudian dilanjutkan dengan sub kloning ke vektor ekspresi pET-30a dan ditransformasi ke E. coli BL21 (DE3). Keberhasilan proses kloning dan sub kloning dikonfirmasi melalui analisis restriksi dan penentuan urutan nukleotidanya serta dilengkapi dengan identifikasi protein rekombinan yang diekspresikan melalui uji aktivitas secara kuantitatif dan kualitatif. Sub kloning gen bcfd1 yang berukuran 870 bp ke vektor ekspresi pET-30a telah berhasil dilakukan. Hal ini dibuktikan dengan serangkaian analisis seperti re-PCR, dan pemotongan enzim restriksi serta penentuan urutan nukleotidanya, yaitu diperolehnya ukuran fragmen DNA dan urutan nukleotida yang sesuai. Hasil analisis pada SDS PAGE menunjukkan bahwa gen bcfd1 rekombinan dari Bacillus cereus strain lokal telah berhasil diekspresikan, terlihat sebagai pita tebal pada daerah sekitar 37 kD. Protein yang diekspresikan memiliki ukuran yang lebih besar karena adanya penambahan beberapa asam amino yang berasal dari fusi protein His-tag, S-tag, dan sisi pemotongan enterokinase pada daerah ujung N. Ekspresi tinggi protein Bcfd1 diperoleh dengan penginduksian kultur pada OD550 0,8-1,0 menggunakan 0,01 mM IPTG, kemudian diinkubasi dengan pengocokan pada 200 rpm selama 2 jam di suhu 30 oC. Analisis zymogram membuktikan bahwa protein rekombinan yang dihasilkan memiliki aktivitas dehalogenase dengan terbentuknya endapan putih AgCl pada gel setelah gel direndam dalam larutan AgNO3 0,1 M. Hasil uji aktivitas dehalogenase kuantitatif Bcfd1 terhadap monokloro asetat memberikan aktivitas spesifik sebesar 37 U/mg pada suhu 30 oC, pH 9. Bcfd1 rekombinan yang diekspresikan pada suhu 30 oC memilki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan pada suhu 37 oC. Penurunan suhu induksi dapat meningkatkan kelarutan protein dan menekan aktivitas protease, sehingga diperoleh protein aktif yang lebih banyak. Analisis prediksi struktur tiga dimensi protein Bcfd1 menunjukkan bahwa protein ini memilki motif pelipatan ?/ß-hidrolase yang lestari di keluarga haloacid dehalogenase dan tersusun oleh dua domain, yaitu domain cop dan domain core. Sisi aktif Bcfd1 diperkirakan berada pada daerah antar muka ke dua domain.