Perpustakaan Digital ITB

Pati merupakan polisakarida yang tersusun atas amilosa dan amilopektin. Kebutuhan pati sebagai sumber makanan meningkat seiring bertambahnya jumlah penduduk. Selain sebagai sumber bahan makanan, pati juga digunakan sebagai bahan baku pada beberapa industri seperti industri makanan, deterjen, kertas, dan produksi bioetanol. Proses hidrolisis pati dalam industri secara enzimatik melibatkan dua tahap, yaitu likuifaksi dan sakarifikasi. Pada tahap likuifaksi, pati digelatinisasi pada suhu tinggi sehingga tahap ini membutuhkan energi lebih tinggi dan akan menambah biaya produksi. ?-Amilase yang mampu menghidrolisis pati pada suhu di bawah suhu gelatinisasi telah banyak dipelajari. Pada penelitian sebelumnya, telah ditemukan ?-amilase baru dari Bacillus megaterium NL3, BmaN1, pendegradasi pati mentah. BmaN1 diketahui hanya mempunyai satu residu katalitik yang lestari yaitu residu glutamat, tidak mempunyai domain pengikat pati, dan aktivitas enzimnya tidak bergantung dengan adanya ion Ca2+. Tujuan penelitian ini adalah melakukan kloning gen pengode ?-amilase B. megaterium NL3, mengekspresikan BmaN1 rekombinan pada E. coli ArcticExpress (DE3) sebagai sel inang, dan mengkarakterisasi sifat biokimia BmaN1 rekombinan. Gen bmaN1 diamplifikasi dengan PCR menggunakan primer yang mengandung sisi restriksi BamHI dan EagI. Amplifikasi fragmen bmaN1 menghasilkan fragmen dengan ukuran ~1,5 kb. Fragmen bmaN1 diligasi dengan vektor kloning pGEM-T. Plasmid rekombinan pGEM-bmaN1 selanjutnya dipotong dengan enzim restriksi BamHI dan EagI, begitu juga dengan vektor ekspresi pET-30a. Kedua fragmen diligasikan dan ditransformasikan pad E. coli TOP 10F’. Plasmid rekombinan pET30a-bmaN1 diekspresikan pada E. coli ArcticExpress (DE3) dengan penambahan IPTG sebagai penginduksi. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa bmaN1 memiliki kemiripan 98% dengan ?-amilase Bacillus megaterium QM B1551 dan B. megaterium DSM319 serta 95% denga ?-amilase B. megaterium WSH-002. bmaN1 mengode 538 asam amino tanpa sinyal peptida dan memiliki urutan polihistidin pada ujung N dan C terminal. Hasil penjajaran asam amino menunjukkan bahwa BmaN1 termasuk ke dalam Glycoside Hydrolase (GH) famili 13. BmaN1 diketahui hanya memiliki satu residu katalitik yang lestari yaitu residu glutamat (Glu259) yang terletak pada daerah II. Selain itu, BmaN1 juga diketahui memiliki dua residu triptofan yang berurutan yaitu Trp217 dan Trp218. Kedua residu ini diperkirakan bertindak sebagai residu pengikat yang memungkinkan berinteraksi dengan molekul glukosa karena rantai samping triptofan yang mengarah keluar. BmaN1 diekpresikan sebagai protein terlarut dan tidak terlarut pada sel inang. Hasil SDS PAGE menunjukkan bahwa massa molekul BmaN1 sekitar 59 kDa. Protein rekombinan BmaN1 mempunyai kemampuan mendegradasi pati terlarut, amilopektin, pullulan, dan ?-siklodekstrin. Aktivitas hidrolisis relatif BmaN1 terhadap substrat-substrat terlarut adalah sebagai berikut amilopektin ? pati terlarut ? ?-siklodekstrin ? pullulan. BmaN1 juga mampu menghidrolisis pati singkong, ganyong, beras, kentang dan jagung. Beras merupakan substrat yang paling sukar dihidrolisis oleh BmaN1.