2017_DS_PP_PURWAENI_1-COVER.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_1.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_2.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_3.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_4.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_5.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-BAB_6.pdf
PUBLIC yana mulyana 2017_DS_PP_PURWAENI_1-PUSTAKA.pdf
PUBLIC yana mulyana
Protein fibrinolitik memiliki peranan penting dalam pengobatan penyakit
kardiovaskular dan dapat diproduksi oleh bakteri pada makanan tradisional
terfermentasi seperti Natto Jepang, Douci China, dan Chungkook-Jang Korea.
Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan DNA pengkode protein fibrinolitik
bakteri dari makanan fermentasi Indonesia, mengekspresikannya dalam sistem
Escherichia coli, dan mengkarakterisasi proteinnya. Urutan DNA pengkode protein
fibrinolitik bakteri diperoleh melalui metode amplifikasi Polymerase Chain
Reaction (PCR) dengan pendekatan metagenomik. Produk PCR diligasi ke vektor
kloning pGEM-T Easy dan vektor rekombinan dikonfirmasi kebenarannya. Urutan
DNA pengkode protein fibrinolitik diligasikan ke dalam vektor ekspresi pET16b(+)
untuk overproduksi protein dalam sel inang E. coli BL21(DE3). DNA pengkode
protein fibrinolitik pembanding (NAT-WT dan DFEG169A) dikonstruksi secara
sintetis dan disisipkan ke dalam pET16b(+). Overproduksi protein dilakukan pada
37°C dengan induksi 0,1 mM IPTG. Protein dimurnikan dengan dua tahap
pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion dan kromatografi filtrasi gel.
Karakterisasi meliputi aktivitas proteolitik dan fibrinolitik, pengaruh pH, suhu,
inhibitor, dan ion logam serta uji spesifik fibrin dilakukan terhadap protein
fibrinolitik rekombinan murni. Hasil analisis urutan DNA sisipan menunjukkan
urutan deduksi asam amino dengan homologi lebih dari 95% terhadap nattokinase
(NAT, AAO65246) dan homologi 100% terhadap Douci Fibrinolytic Enzyme
(DFE, AAZ66858). Variasi asam amino yang banyak ditemukan di NAT dari
Tauco kering (NAT-TK) dan Oncom kuning (NAT-OC) pada daerah ujung
karboksi dan posisi lainnya yaitu D41N dan V192A (NAT-TK), V4F, D41N, dan
V192A (NAT-OC). Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan keberadan protein
fibrinolitik matang 28 kDa dalam bentuk terlarut. Ekstrak kasar yang mengandung
ii
protein fibrinolitik rekombinan matang menunjukkan aktivitas protease ketika diuji
pada pelat kasein dan fibrin. Hasil karakterisasi protein fibrinolitik 28 kDa murni
menunjukkan bahwa NAT-TK dan NAT-OC mendegradasi fragmen ?dan ?
fibrinogen dan memiliki aktivitas protein optimum pada pH 7 dan suhu 50°C. NATWT hanya mendegradasi fragmen ?fibrinogen dan memiliki aktivitas optimum
pada pH 8 dan suhu 50°C. NAT-TK dan NAT-OC masih memiliki aktivitas
fibrinolitik di atas 80% pada pH 8-9, sedangkan NAT-WT pada pH 9-10. DFE dan
DFEG169A memiliki aktivitas protein optimum pada pH 8 dan 50°C. DFEG169A
mendegradasi fragmen ?, ?, dan ?fibrinogen lebih cepat daripada DFE dan
memiliki aktivitas spesifik fibrin yang tinggi diantara protein fibrinolitik
rekombinan lainnya. Protein-protein fibrinolitik rekombinan ini masih memiliki
aktivitas fibrinolitik dengan keberadaan 0,1 mM SDS dan EDTA dan turun
aktivitasnya 10% lebih oleh adanya ion Ca
2+.
Penelitian ini berhasil menapis DNA
pengkode NAT dan DFE dari makanan fermentasi Indonesia dan memproduksi
protein rekombinan matang terlarutnya dalam sistem E. coli. Protein-protein
fibrinolitik rekombinan ini memiliki karakter yang bervariasi dan berpotensi untuk
dikembangkan lebih lanjut dalam terapi trombosis.