Article Details

ISOLASI DNA PENGKODE PROTEIN FIBRINOLITIK DARI BAKTERI DALAM MAKANAN FERMENTASI INDONESIA MENGGUNAKAN PENDEKATAN METAGENOMIK DAN KARAKTERISASI PRODUK EKSPRESINYA

Oleh   Purwaeni [30712011]
Kontributor / Dosen Pembimbing : Dr. Debbie Sofie Retnoningrum;Dr. Catur Riani;
Jenis Koleksi : S3-Disertasi
Penerbit : Farmasi
Fakultas : Sekolah Farmasi (SF)
Subjek : Pharmacology & therapeutics
Kata Kunci : DFE, fibrin spesifik, fibrinolitik, makanan fermentasi, metagenomik, nattokinase
Sumber :
Staf Input/Edit : yana mulyana   Ena Sukmana
File : 8 file
Tanggal Input : 2019-01-02 10:05:04

Protein fibrinolitik memiliki peranan penting dalam pengobatan penyakit kardiovaskular dan dapat diproduksi oleh bakteri pada makanan tradisional terfermentasi seperti Natto Jepang, Douci China, dan Chungkook-Jang Korea. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan DNA pengkode protein fibrinolitik bakteri dari makanan fermentasi Indonesia, mengekspresikannya dalam sistem Escherichia coli, dan mengkarakterisasi proteinnya. Urutan DNA pengkode protein fibrinolitik bakteri diperoleh melalui metode amplifikasi Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan pendekatan metagenomik. Produk PCR diligasi ke vektor kloning pGEM-T Easy dan vektor rekombinan dikonfirmasi kebenarannya. Urutan DNA pengkode protein fibrinolitik diligasikan ke dalam vektor ekspresi pET16b(+) untuk overproduksi protein dalam sel inang E. coli BL21(DE3). DNA pengkode protein fibrinolitik pembanding (NAT-WT dan DFEG169A) dikonstruksi secara sintetis dan disisipkan ke dalam pET16b(+). Overproduksi protein dilakukan pada 37°C dengan induksi 0,1 mM IPTG. Protein dimurnikan dengan dua tahap pemurnian menggunakan kromatografi penukar ion dan kromatografi filtrasi gel. Karakterisasi meliputi aktivitas proteolitik dan fibrinolitik, pengaruh pH, suhu, inhibitor, dan ion logam serta uji spesifik fibrin dilakukan terhadap protein fibrinolitik rekombinan murni. Hasil analisis urutan DNA sisipan menunjukkan urutan deduksi asam amino dengan homologi lebih dari 95% terhadap nattokinase (NAT, AAO65246) dan homologi 100% terhadap Douci Fibrinolytic Enzyme (DFE, AAZ66858). Variasi asam amino yang banyak ditemukan di NAT dari Tauco kering (NAT-TK) dan Oncom kuning (NAT-OC) pada daerah ujung karboksi dan posisi lainnya yaitu D41N dan V192A (NAT-TK), V4F, D41N, dan V192A (NAT-OC). Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan keberadan protein fibrinolitik matang 28 kDa dalam bentuk terlarut. Ekstrak kasar yang mengandung ii protein fibrinolitik rekombinan matang menunjukkan aktivitas protease ketika diuji pada pelat kasein dan fibrin. Hasil karakterisasi protein fibrinolitik 28 kDa murni menunjukkan bahwa NAT-TK dan NAT-OC mendegradasi fragmen ?dan ? fibrinogen dan memiliki aktivitas protein optimum pada pH 7 dan suhu 50°C. NATWT hanya mendegradasi fragmen ?fibrinogen dan memiliki aktivitas optimum pada pH 8 dan suhu 50°C. NAT-TK dan NAT-OC masih memiliki aktivitas fibrinolitik di atas 80% pada pH 8-9, sedangkan NAT-WT pada pH 9-10. DFE dan DFEG169A memiliki aktivitas protein optimum pada pH 8 dan 50°C. DFEG169A mendegradasi fragmen ?, ?, dan ?fibrinogen lebih cepat daripada DFE dan memiliki aktivitas spesifik fibrin yang tinggi diantara protein fibrinolitik rekombinan lainnya. Protein-protein fibrinolitik rekombinan ini masih memiliki aktivitas fibrinolitik dengan keberadaan 0,1 mM SDS dan EDTA dan turun aktivitasnya 10% lebih oleh adanya ion Ca 2+. Penelitian ini berhasil menapis DNA pengkode NAT dan DFE dari makanan fermentasi Indonesia dan memproduksi protein rekombinan matang terlarutnya dalam sistem E. coli. Protein-protein fibrinolitik rekombinan ini memiliki karakter yang bervariasi dan berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut dalam terapi trombosis.