Perpustakaan Digital ITB

Siklodekstrin glikosiltransferase (CGTase; EC 2.4.1.19) adalah enzim yang memproduksi siklodekstrin (CD)-?,-?dan -?dari pati. Rasio pembentukan setiap CD berbeda tergantung jenis CGTase. Beberapa studi pada CGTase menunjukkan bahwa residu pada loop 145-152 yang membentuk subsitus -7 enzim CGTase penting dalam pembentukan jenis CD yang ukurannya lebih besar. Pada penelitian ini dilakukan mutasi pada DNA pengkode residu 144-152 CGTase A2-5a rekombinan untuk menghasilkan enzim mutein (A144V/L145D/?(146-151)/A152I) yang selanjutnya dikarakterisasi beberapa parameter enzimatiknya. Penelitian dimulai dengan mengkonstruksi cgtase mutan menggunakan mutagenesis terarah berbasis PCR. Perubahan kodon dilakukan melalui primer mutan yang dirancang pada penelitian ini. Konfirmasi cgtase mutan dilakukan dengan analisis migrasi dan sekuensing. Selanjutnya cgtase mutan ditransformasikan ke Escherichia coli BL21(DE3) untuk digunakan dalam proses overproduksi mutein dengan induksi IPTG 0,1 mM selama 6 jam pada 26 C. Mutein dimurnikan dengan resin Ni-NTA. Karakterisasi enzimatik meliputi spesifisitas produk, aktivitas hidrolisis pati, siklisasi-?, suhu optimum, pH optimum, dan kinetika enzim yang dibandingkan dengan enzim natifnya. cgtase mutan telah berhasil dikonstruksi dan dikonfirmasi kebenarannya dengan analisis migrasi dan sekuensing. rCGTase natif dan mutein telah berhasil dioverproduksi dalam media LB dan didapat rCGTase murni berukuran 76,39 kDa dengan kromatografi afinitas kolom Ni-NTA. Karakterisasi enzimatik mutein rCGTase menunjukkan spesifisitas produk, aktivitas hidrolisis pati, dan siklisasi-?tidak berubah. Suhu dan pH optimum untuk memproduksi CD juga tidak berubah. Parameter kinetika enzim mutein rCGTase sedikit berbeda dari rCGTase natif dalam memproduksi CD-?menggunakan soluble starch yang dipanaskan. Pada penelitian ini, telah berhasil dikonstruksi cgtase mutan dan dikarakterisasi mutein rCGTase dimana mutasi tidak memberi pengaruh terhadap semua pengujian kecuali nilai kinetika enzim.