Perpustakaan Digital ITB

Selulosa –yang merupakan sumber biomassa terbesar di bumi- adalah polimer dari glukosa yang dihubungkan oleh ikatan beta-1,4 glikosida. Biomassa tersebut dapat dimanfaatkan sebagai sumber bahan energi terbarukan dalam bentuk bioetanol. Selulosa didegradasi menjadi glukosa oleh selulase yang merupakan enzim hidrolitik. Selulase merupakan enzim kompleks yang tersusun dari tiga jenis enzim, yaitu endoglukanase (EC 3.2.1.4) yang memotong rantai selulosa secara acak, eksoglukanase (EC 3.2.1.74 dan EC 3.2.1.91) yang memotong rantai selulosa dari ujung pereduksi dan non pereduksi, dan beta-glukosidase (EC 3.2.1.21) yang memotong selobiosa menjadi glukosa. Sampai saat ini belum ditemukan selulase yang berkarakteristik tepat untuk mendegradasi struktur kristal selulosa yang tidak larut dalam air. Pada penelitian terdahulu, gen pengode endoglukanase dari bakteri laut Bacillus amyloliquefaciens PSM 3.1 telah berhasil diisolasi dan diekspresikan pada sel inang Escherichia coli BL21 (DE3). Endoglukanase yang diekspresikan memiliki suhu optimum 50 oC, pH 6,0, dan aktivitas maksimum tersisa 50% pada rentang 40-60 oC. Selain itu, endoglukanase masih mempertahankan 90% aktivitasnya di dalam NaCl 2 M. Namun, endoglukanase disekresikan secara intraseluler dan aktivitasnya tidak cukup besar sehingga tidak praktis untuk diaplikasikan pada industri. Untuk mendapat selulase rekombinan yang dapat mendegradasi selulosa secara efisien, perlu dilakukan rekayasa genetika. Penelitian ini bertujuan untuk mengonstruksi selulase rekombinan dalam sistem ekspresi ekstraselular pada sel inang Bacillus megaterium MS941. Metode penelitian meliputi isolasi gen beta-glukosidase, konstruksi fusi gen selulase, menentukan kondisi produksi selulase, karakterisasi selulase rekombinan dan karakterisasi produk degradasi selulosa oleh selulase rekombinan. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa gen beta-glukosidase (bglZ) yang berukuran 1398 bp dan mengode 465 residu asam amino telah berhasil diisolasi. Protein tersebut termasuk pada keluarga glikosil hidrolase 1 dan diprediksi memiliki residu katalitik yang terletak pada Glu171 dan Glu364. Hidrolisis selulosa menjadi glukosa diperlukan minimal 2 jenis selulase, yaitu: endoglukanase atau selobiohidrolase dan beta-glukosidase. Untuk keperluan tersebut, pada penelitian ini dibuat empat konstruksi rekombinan, yaitu: rekombinan fusi EglII-BglZ (protein gabungan antara endoglukanase dan beta-glukosidase), BglZ-EglII (dua protein: beta-glukosidase dan endoglukanase yang diekspresikan bersamaan oleh satu sel inang), EglII, dan BglZ pada vektor ekspresi pMM1525 yang kemudian diekspresikan dalam sel inang B. megaterium MS941. Keempat rekombinan tersebut berhasil dikonstruksi dan diekspresikan kecuali rekombinan fusi EglII-BglZ. Rekombinan EglII yang ditanam dalam medium modifikasi (bakto pepton 1%, ekstrak ragi 0,5%, dan NaCl 1%) menghasilkan aktivitas maksimum setelah diinduksi selama 6 jam. EglII rekombinan memiliki nilai KM = 7,913 mM dan Vmax = 0,384 mM menit-1. Aktivitas EglII rekombinan, BglZ-EglII dan BglZ diuji pada substrat: CMC (karboksi metil selulosa) avicel (selulosa mikrokristalin), dan selulosa dari bagas tebu. Rekombinan EglII dapat menghidrolisis substrat CMC, avicel, pNPC, dan bagas tebu dengan aktivitas tertinggi didapatkan pada hasil reaksi dengan substrat pNPC dan CMC yang merupakan substrat selulosa yang larut dalam air. Campuran EglII dan BglZ rekombinan menghidrolisis avicel dan bagas tebu menghasilkan gula pereduksi berturut-turut dengan nilai 4,161 (konsentrasi avicel 20% (b/v)) dan 4,692 (mu)mol (konsentrasi selulosa bagas tebu 20% (b/v)). Berdasarkan hasil kromatografi lapis tipis rekombinan: EglII, BglZ-EglII, dan campuran EglII dan BglZ mampu menghidrolisis avicel menjadi selobiosa dan glukosa.