Perpustakaan Digital ITB

Poliketida adalah metabolit sekunder yang dihasilkan oleh tanaman, hewan, jamur, dan bakteri. Poliketida merupakan hasil reaksi penggabungan rantai karbon kelipatan C2 yang berasal dari asam lemak. α-Piron adalah contoh poliketida yang terdapat pada lapisan lipid dan glikolipid dinding sel Mycobactrium tuberculosis. Biosintesis poliketida dikatalisis oleh Poliketida sintase (PKS). Berdasarkan jumlah subunit dan mekanisme sintesis, PKS dibagi menjadi tiga tipe, yaitu PKS tipe I, PKS tipe II, dan PKS tipe III. PKS18 dari M. tuberculosis termasuk kedalam PKS tipe III yang mengkatalisis sintesis α-piron. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari struktur dan fungsi PKS tipe III dari dua isolat klinis M. tuberculosis, yaitu isolat L26 dan H37. Hasil amplifikasi open reading frame gen pks18 dari dua galur isolat klinis tersebut diklon ke vektor pGEM-T, disubklon ke vektor ekspresi pET-30a(+), kemudian diekspresikan dalam Escherichia coli BL21(DE3). PKS18 rekombinan dimurnikan dan dikarakterisasi untuk mengetahui kemampuannya dalam mengkatalisis reaksi sintesis poliketida α-piron. Gen pks18 diamplifikasi menggunakan satu pasang primer yang dirancang berdasarkan gen pks18 pada M. tuberculosis galur H37Rv (GenBank accession no. P9WPFI). Urutan nukleotida primer maju yang digunakan adalah 5'- ggatccATGAACGTCTCAGCTGAGAG-3' dan urutan primer balik yang digunakan adalah 5'-aagcttTCACCGTCGGATGATGTCGA-3'. Amplikon yang berukuran 1,2 kb telah berhasil diklon ke dalam vektor kloning pGEM-T. Amplikon ini kemudian disisipkan pada vektor ekspresi pET-30a(+) menghasilkan plasmid pET-pks18 rekombinan. Analisis pensejajaran urutan nukleotida gen pks18 antara M. tuberculosis galur H37Rv (sebagai galur acuan) dan M. tuberculosis isolat klinis menunjukkan bahwa psk18 dari L26 mempunyai urutan nukleotida yang identik dengan pks18 dari H37Rv, sedangkan pks18 dari H37 memiliki dua mutasi. Mutasi pada pks18 dari H37 adalah C823T dan C1142T yang menghasilkan substitusi asam amino Cys275Arg dan Val381Ala. Kedua perbedaan asam amino ini belum pernah dilaporkan. Gen pks18 diekspresikan pada E. coli BL21(DE3) dengan menambahkan IPTG sebagai penginduksi. Analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa PKS18 dari H37 (PKS18_H37) dan PKS18 dari L26 (PKS18_26) diekspresikan sebagai protein terlarut dan badan inklusi (agregat) yang berukuran ~48 kDa. SDS-PAGE, intensitas pita protein PKS18_H37 yang berbentuk agregat lebih tinggi daripada PKS18_L26 yang mengindikasikan kelarutan PKS18_H37 lebih kecil daripada PKS18_L26. Kemampuan PKS18_L26 dan PKS18_H37 dalam mengkatalisis biosintesis poliketida α-piron dipelajari dengan menggunakan malonil-KoA sebagai unit pemanjang dan heksanoil-KoA sebagai starter. Berdasarkan analisis kromatogram KLT, produk hasil katalisis PKS18_L26 mempunyai noda baru yang memiliki nilai Rf lebih tinggi dari malonil-KoA dan heksanoil-KoA, sedangkan pada PKS18_H37 tidak ditemukan adanya noda produk hasil reaksi. Selain itu, kromatogram HPLC hasil sintesis α-piron dari malonil-KoA sebagai starter dan unit pemanjang mengindikasikan PKS18_L26 mampu mengkatalisis pembentukan poliketida α-piron. Namun, PKS18_H37 tidak dapat mengkatalisis biosintesis poliketida α-piron yang mengindikasikan bahwa PKS18_H37 tidak aktif. Analisis pemodelan struktur PKS18_L26 menunjukkan bahwa PKS18_L26 memiliki struktur yang sama dengan PKS18_H37Rv. Struktur sekunder pada PKS18_H37 mengalami perubahan akibat dari substitusi Cys275 menjadi Arg275, namun substitusi Val381Ala tidak mempengaruhi struktur. Cys275Arg berada pada saluran pengikat substrat, sehingga perubahan struktur diduga mengakibatkan penyempitan saluran dan menghambat jalan substrat menuju sisi katalitik. Berdasarkan hasil penelitian ini, ditemukan adanya keterkaitan antara struktur dan fungsi PKS18 pada reaksi biosintesis poliketida α-piron. Oleh karena itu, diperlukan pengkajian secara mendalam struktur tiga dimensi PKS18_H37, serta mengisolasi α-piron dari isolat klinis M. tuberculosis L26 dan H37 untuk mempelajari fungsi PKS18 secara in vivo. Selain itu, perlu dilakukan kajian PKS18 dari berbagai macam isolat klinis M. tuberculosis untuk dapat mempelajari hubungan pengaruh keberadaan α-piron pada dinding sel dengan sensitivitas isolat klinis terhadap obat.