Perpustakaan Digital ITB

Sortase D merupakan enzim yang dapat menghidrolisis ikatan peptida pada protein yang memiliki sinyal penyortiran yang spesifik yaitu LPXTA. Reaksi hidrolisis protein oleh sortase D terjadi di antara dua residu threonin dan alanin pada motif LPXTA menggunakan residu katalitik sistein. Gen pengode kitosanase yang kami miliki mengandung motif yang mirip dengan sinyal penyortiran sortase D, yaitu GLXTA. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk merekayasa urutan asam amino penyusun kitosanase sehingga memiliki sinyal sortir yang dapat dikenali oleh Sortase D Rossellomorea aquimaris MKSC 6.2. (RaqSrtD). Penelitian ini diawali dengan merubah urutan gen pengode kitosanase sehingga memiliki kode untuk sinyal penyortiran LPXTA menggunakan site-directed mutagenesis (SDM). Perubahan kodon dilakukan pada G166L dan L167P menghasilkan csn1LP. Plasmid rekombinan pET-30a-csn1LP kemudian digunakan untuk mentransformasi E. coli TOP10F'. Verifikasi keberhasilan terbentuknya pET-30a-csn1LP dilakukan dengan analisis restriksi dan sekuensing. Klon rekombinan yang mengandung gen pengode Csn1LP dan RaqSrtD selanjutnya masing-masing diekspresikan pada E. coli BL21(DE3). Protein Csn1LP dihasilkan sebagai badan inklusi berukuran ~31 kDa. Sementara, RaqSrtD terbentuk sebagai protein larut yang berukuran ~28,3 kDa. Hasil reaksi antara protein badan inklusi Csn1LP dengan protein larut RaqSrtD yang diamati menggunakan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) belum menunjukkan pita produk hidrolisis (berukuran ~18,9 kDa dan ~12,5 kDa) yang meyakinkan. Namun, rekayasa kitosanase sehingga memiliki motif LPXTA telah berhasil dilakukan dan diverifikasi dengan sekuensing.