Perpustakaan Digital ITB

Pemanfaatan Escherichia coli sebagai inang produksi protein rekombinan sangat diminati karena pertumbuhannya cepat, biaya produksinya rendah, dan mudah dimanipulasi secara genetik. Saat ini, lebih dari 60% pangsa pasar keseluruhan produk protein rekombinan diserap oleh industri farmasi. Dalam pemenuhan kebutuhan tersebut, sistem ekspresi menggunakan sel bakteri menempati urutan pertama dan mendominasi pasar dibandingkan inang lain seperti ragi maupun sel mamalia. Namun, aplikasi pemanfaatan E. coli untuk produk terapeutik ini terhambat oleh keberadaan lipopolisakarida (LPS) pada membran luarnya yang bersifat endotoksin dan dapat memicu respons inflamasi sehingga menjadi tantangan dalam produksi protein terapeutik dan vaksin. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan desain rekayasa galur E. coli rendah endotoksin melalui knock-out gen lpxM. Delesi gen lpxM akan memodifikasi struktur lipid A LPS menjadi penta-asilasi yang kurang imunogenik terhadap reseptor TLR4/MD2 sehingga menjadi less endotoxin. Galur yang telah kehilangan gen lpxM kemudian dilakukan karakterisasi fenotipik, seperti perubahan struktur mikroskopik, pertumbuhan sel, serta fungsIonalitasnya sebagai inang untuk ekspresi protein rekombinan. Delesi gen dilakukan menggunakan protokol lambda red-mediated genome recombineering. Konstruk mutasi pada penelitian ini diproduksi menggunakan primer dengan homologous arm yang menargetkan area konservatif pada gen lpxM, sehingga desain ini dapat diaplikasikan secara fleksibel pada berbagai galur E. coli untuk aplikasi bioteknologi. Konstruk tersebut mengandung gen resistensi kanamisin yang diapit situs flippase recognition target (FRT) untuk proses curing gen lanjutan. Recombineering dilakukan pada dua galur E. coli model, yaitu BL21 (DE3) dan SCM6, serta sequencing DNA dilakukan untuk mengonfirmasi penghilangan gen target lpxM serta curing marka resistensi. Analisis fenotipik melalui pewarnaan Gram menunjukkan bahwa galur E. coli mutan ?lpxM tidak mengalami perubahan morfologi sel dan karakteristik pewarnaan Gram jika dibandingkan dengan wild-type. Selain itu, diamati adanya penurunan laju pertumbuhan spesifik pada galur SCM6 dan BL21 (DE3) mutan terhadap wildtype, yakni 1,0 jam-1 dan 1,14 jam-1 menjadi 0,9 jam-1 dan 1,00 jam-1, meskipun secara statistik tidak signifikan (P>0,05). Analisis produksi protein rekombinan PfCyRPA (antigen malaria) dan IL-10 (Interleukin 10) pada E. coli BL21(DE3) menunjukkan bahwa galur mutan ?lpxM mampu mengekspresikan kedua protein tersebut (masing-masing dengan ukuran protein sebesar 21,58 kDa dan 22,8 kDa) pada fraksi sel total, sedangkan analisis produksi protein rekombinan rH5-GT (kandidat vaksin glikokonjugat Hemagglutinin H5N1) di E. coli SCM6 menunjukkan bahwa ekspresi protein target (68,8 kDa) tersupresi pada galur mutan ?lpxM dibandingkan dengan wild-type. Secara keseluruhan, galur mutan E. coli menunjukkan potensi rekombinan dalam aplikasi vaksin dan protein terapeutik.