Perpustakaan Digital ITB

Fosfolipase mirip patatin adalah enzim yang berperan dalam menghidrolisis ikatan ester fosfolipid. Isolat lokal AL17 diketahui mengandung gen yang mengkode fosfolipase mirip patatin. Penelitian ini berfokus untuk mendapatkan fosfolipase mirip patatin dari AL17 dan mengkarakterisasi sifat-sifatnya. Penelitian ini dilakukan dalam empat tahap utama, yaitu kloning gen, analisis bioinformatika dan biokomputasi gen, ekspresi, dan karakterisasi enzim. Untuk kloning gen, dua pasang primer spesifik dirancang untuk mengamplifikasi gen target dari genom bakteri. Hasil amplifikasi diperoleh dua fragmen gen, yaitu patatin-like phospholipase 1 (ITBPLP1) dan patatin-like phospholipase 2 (ITBPLP2), dengan ukuran masing-masing 2,3 dan 1,1 kb. Fragmen gen ini kemudian diligasi ke vektor kloning, menghasilkan plasmid rekombinan, yaitu pJET-ITBPLP1 dan pJET ITBPLP2, yang digunakan untuk transformasi Escherichia coli TOP10. Plasmid tersebut dianalisis lebih lanjut melalui sekuensing dan bioinformatika. Sekuens tersebut diterjemahkan menjadi asam amino, yang menunjukkan adanya empat daerah penting yang dilestarikan. Selain itu, sekuens tersebut menunjukkan tingkat kemiripan sebesar 46% dan 39% dengan gen yang serupa dari Pseudomonas aeruginosa. Untuk ekspresi, gen-gen tersebut diamplifikasi ulang menggunakan primer ekspresi yang mengandung NdeI dan SalI. Setelah amplifikasi, amplikon disisipkan ke pET30a (+) pada sisi restriksi NdeI dan SalI, menghasilkan pET ITBPLP1.1, pET-ITBPLP1.2, dan pET-ITBPLP2. Vektor ekspresi rekombinan digunakan untuk mentransformasi Escherichia coli BL21 (DE3). Gen-gen tersebut diekspresikan pada Luria Bertani pada suhu 37 °C dengan induksi IPTG. Protein diisolasi menggunakan metode lisis alkali dengan 0,1% SDS. Setelah dilakukan SDS-PAGE, hasilnya menunjukkan bahwa ITBPlp1.1 dan ITBPlp1.2 telah diekspresikan secara berlebihan, sedangkan ITBPlp2 diekspresikan pada tingkat yang rendah. Ketiga enzim tersebut menunjukkan aktivitas hidrolisis pada para nitrofenil dekanoat. Karakterisasi in silico menggunakan molecular docking menunjukkan bahwa enzim ITBPlp1 lebih menyukai para-nitrofenil butirat, sedangkan ITBPlp2 lebih menyukai para-nitrofenil dekanoat.