Perpustakaan Digital ITB

Enzim N-linked oligosakariltransferase (OST) prokariot pertama, yakni PglB dari Campylobacter jejuni (PglBCj), merupakan komponen utama serta OST yang paling umum digunakan dalam Protein Glycan Coupling Technology (PGCT). Akan tetapi, PglBCj terikat pada aturan spesifisitas sequon minus two (-2) sehingga protein ini hanya dapat mengenali sequon kanonik atau sequon dengan residu bermuatan negatif pada posisi -2 sebelum residu akseptor asparagin (D/E-X-N-X-S/T, X ? P ), berbeda dengan OST eukariot yang memiliki spesifisitas pengenalan yang lebih relaks (N-X-S/T). Studi oleh Sotomayor et al. (2025) menemukan homolog PglB prokariot dari bakteri pereduksi sulfat Desulfovibrio marinus (PglBDm) yang mampu melakukan glikosilasi terhadap protein dengan sequon non-kanonik seperti QYNST. Kemampuan glikosilasi PglBDm yang lebih relaks diduga dipengaruhi oleh keberadaan motif pengenalan sequon pada external loop 5 (EL5) yang homolog dengan motif SVXE pada OST eukariot, berbeda dengan motif TIXE pada PglBCj. Akan tetapi, dampak transplantasi motif EL5 PglBDm pada PglBCj masih belum dilaporkan, baik secara komputasional maupun melalui konstruksi gen mutan yang dapat diuji lebih lanjut. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis secara in silico pengaruh mutagenesis TIQE?SVIE pada motif EL5 PglBCj serta menghasilkan konstruk kloning gen pglBCj SVIE. Analisis in silico pada penelitian ini mencakup pemodelan mutasi menggunakan struktur kristal PglB dari C. lari (PDB ID: 5OGL) sebagai homolog PglBCj (PyMOL), prediksi stabilitas termodinamika struktur (BuildModel FoldX, Rosetta), penambatan molekuler (HPEPDOCK 2.0), dan analisis energetika kompleks serta pemetaan elektrostatik protein (AnalyseComplex FoldX, APBS PyMOL). Konstruk kloning gen pglBCj SVIE dihasilkan dengan substitusi asam amino T313S, I314V, dan Q315I melalui PCR, overlap-extension PCR, dan perakitan Gibson. Verifikasi konstruk dilakukan melalui PCR koloni transforman, analisis restriksi konstruk, serta analisis sekuensing Sanger. Hasil analisis in silico menunjukkan bahwa mutasi berpotensi menjaga stabilitas termodinamika protein, mempertahankan distribusi muatan elektrostatik global, meningkatkan nilai total energi terhadap interaksi dengan peptida QYNST. Selain itu, evaluasi pose docking menunjukkan prediksi bahwa mutan dapat mengakomodasi QYNST ke dalam binding site yang ditentukan, berbeda dengan protein wild-type yang posenya jatuh di luar binding site (offbinding site). Konstruksi kloning gen pglBCj SVIE terkonfirmasi berdasarkan hasil PCR koloni dan hasil analisis restriksi yang menunjukkan pita yang sesuai (insert 2290 bp dan konstruk 5271 bp) serta hasil sekuensing Sanger yang menunjukkan keberhasilan substitusi T313S, I314V, dan Q315I dengan 100% pairwise identity terhadap sekuens referensi. Gen pglBCj SVIE yang dihasilkan pada studi ini masih belum membuktikan ekspresi maupun relaksasi aktivitas glikosilasi sehingga ekspresinya, stabilitas dalam membran, serta aktivitas dan spesifisitas glikosilasinya masih memerlukan validasi eksperimental.