Perpustakaan Digital ITB

Produksi PUFA saat ini mengalami masalah sustainability. Produksi PUFA masih bergantung pada sektor kelautan sedangkan ketersediaan PUFA dari sektor tersebut diproyeksikan akan terus menurun akibat overfishing dan pemanasan global. Aurantiochytrium memiliki potensi untuk digunakan dalam produksi komersil polyunsaturated fatty acid (PUFA) omega-3, terkhusus DHA, yang penting sebagai nutrisi manusia dan akuakultur. Oleh tim penelitian kami, Aurantiochytrium strain lokal telah berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ekosistem bakau di Kalimantan. Aurantiochytrium strain lokal tersebut telah teridentifikasi memiliki gen-gen yang berperan dalam biosintesis PUFA. Penelitian ini berfokus pada eksplorasi kemampuan Aurantiochytrium strain lokal untuk direkayasa secara genetik dengan metode elektroporasi, terutama guna meningkatkan produksi PUFA. Elektroporasi menjadi metode yang paling umum digunakan untuk pengantaran materi genetik, baik sirkular maupun linear, pada berbagai spesies Thraustochytrid karena relatif murah, mudah, dan cepat dibandingkan dengan metode transformasi lain. Sensitivitas Aurantiochytrium strain lokal terhadap antibiotik diuji untuk menentukan agen seleksi dan konsentrasi inhibisi minimum. Aurantiochytrium strain lokal sensitif terhadap zeocin dan hygromycin pada konsentrasi minimum 10 ?g/L, tetapi resistan terhadap chloramphenicol. Vektor dikonstruksi dengan memiliki komponen marka seleksi gen resistansi hygromycin dan kaset overekspresi gen phosphopantetheinyl transferase (PPTase), yang berperan dalam transfer apo-ACP menjadi holo-ACP untuk menginisiasi biosintesis PUFA jalur oxygen independent. Marka seleksi difusikan dengan gen emGFP sebagai salah satu strategi untuk deteksi keberhasilan transformasi melalui pengamatan fluoresensi sel. Masing-masing gen diapit dengan promoter TEF1 dan terminator CYC1 untuk ekspresi pada sel eukariot. Vektor sirkular ditransformasikan ke Aurantiochytrium strain lokal dengan elektroporasi. Kurva standar jumlah sel terhadap absorbansi Aurantiochytrium dibentuk guna menentukan faktor pengenceran dalam pembuatan sel kompeten. Berbagai pengaturan parameter elektroporasi, meliputi jenis pulsa, tegangan (kV/cm), dan panjang pulsa (ms), serta kepadatan sel transforman (sel/mL), divariasikan untuk mendapatkan setidaknya satu transforman dengan ekspresi yang stabil, tidak transient. Transformasi ditargetkan untuk integrasi DNA sirkular secara random pada genom. Transforman diseleksi pada medium padat yang mengandung hygromycin, kemudian ditransfer secara berkala (passaging step dan stability test) untuk mendapatkan transforman dengan ekspresi resistansi hygromycin yang stabil. Dari total 34 koloni transforman, dua diantaranya teruji bersifat stabil resistan terhadap hygromycin. Transforman stabil dikonfirmasi melalui pengamatan fluoresensi GFP (green fluorescence protein) dan analisis integrasi gen target pada genom transforman dengan PCR. Satu transforman memiliki kaset marka seleksi dan kaset overekspresi sedangkan satu transforman lainnya hanya memiliki gen resistansi hygromycin. Hasil penelitian ini membuktikan bahwa Aurantiochytrium sp. dari ekosistem bakau di Kalimantan tersebut mampu direkayasa secara genetik melalui elektrotransformasi. Kompetensi dari Aurantiochytrium strain local untuk dapat direkayasa secara genetic meningkatkan peluang untuk mengeksplorasi berbagai strategi produksi DHA secara komersil, termasuk kombinasinya dengan strategi optimasi bioproses dan strategi rekayasa metabolik dengan pendekatan biologi sintetik.