Perpustakaan Digital ITB

Pandemi COVID-19 yang disebabkan oleh penularan severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) telah berdampak luas pada kesehatan dan ekonomi dalam skala global. Virus yang menyebar secara cepat ke seluruh dunia, mengalami beberapa kali mutasi, dan menyebabkan angka kematian yang tinggi khususnya pada penyebaran SARS-CoV-2 varian Delta. Berbagai platform vaksin dikembangkan dan sudah diberikan di seluruh dunia, sebagai upaya untuk menangani pandemi dan untuk memberikan proteksi dan pencegahan infeksi. Pengembangan platform vaksin yang terjangkau dan mudah diakses diperlukan untuk memberikan proteksi jangka panjang terhadap COVID-19 dan penyakit lain yang disebabkan oleh penyebaran virus. Beberapa platform vaksin COVID-19 yang sudah dikembangkan adalah vaksin virus yang dilemahkan, vaksin virus yang diinaktivasi, vaksin protein subunit, vaksin DNA, vaksin mRNA, dan vaksin vektor virus. Kandidat vaksin berbasis protein subunit merupakan yang paling banyak dikembangkan yaitu 59 dari 183 kandidat vaksin dalam fase uji klinis. Beberapa vaksin COVID-19 berbasi protein subunit yang sudah digunakan yaitu Novavax, Zifivax (ZF2001), COVAX-19, MVC-COV1901, dan Corbevax. Vaksin protein subunit memiliki beberapa kelebihan, yaitu kemampuannya untuk menstimulasi respon imun humoral dan seluler, tidak menginfeksi, dan memiliki efek samping yang ringan. Vaksin protein subunit memerlukan adjuvan untuk meningkatkan respon imun, memerlukan kapasitas produksi besar, dan memerlukan cold chain untuk proses penyimpanan dan distribusi. Beberapa vaksin protein subunit menggunakan antigen receptor binding domain (RBD). RBD merupakan bagian dari protein spike SARS-CoV-2 yang memiliki peran penting pada infeksi virus. RBD berinteraksi dengan reseptor angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) manusia pada awal proses internalisasi virus ke dalam sel inang. RBD dapat merangsang sistem imun untuk menghasilkan antibodi netralisasi yang dapat menghambat interaksi virus dengan ACE2. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa RBD dimer, RBD trimer, dan RBD multimer menghasilkan antibodi netralisasi yang lebih tinggi dibanding RBD monomer. Tujuan penelitian ini adalah mengembangkan kandidat vaksin berbasis protein subunit RBD multimer. RBD multimer dikembangkan dengan melakukan fusi genetik gen pengkode protein RBD dengan gen pengkode peptida ?-annulus (Bann) dari tomato bushy stunt virus (TBSV). Peptida Bann dari TBSV diketahui dapat membentuk virus like nanocapsule, sehingga fusi protein dapat menghasilkan Bann-RBD multimer. Pemodelan molekul Bann-RBD multimer dilakukan secara in silico, konstruksi gen pengkode Bann-RBD ditambahkan pada vektor ekspresi pPICZ?A untuk sistem ekspresi Pichia pastoris X-33. Pemilihan sistem ekspresi ini didasarkan karena P. pastoris X-33 diketahui dapat mengekspresikan protein rekombinan dalam jumlah berlebih dan memiliki modifikasi pasca translasi agar protein memiliki pelipatan yang sesuai. Protein Bann-RBD hasil ekspresi dimurnikan dengan teknik kromatografi afinitas ion logam, lalu dilakukan karakterisasi protein secara biokimia, biofisika, dan dilakukan studi imunogenisitas. Pengembangan kandidat vaksin protein Bann-RBD multimer melibatkan beberapa tahap penelitian. Pada tahap awal, pemodelan struktur protein Bann-RBD multimer secara in silico untuk mendapatkan rancangan fusi peptida Bann dan protein RBD yang sesuai dengan orientasi RBD mengarah ke permukaan protein multimer. Analisis prediksi epitop protein Bann-RBD terhadap sel B dan sel T dilakukan secara in silico untuk mengetahui potensi protein Bann-RBD dalam menghasilkan respon imun. Berikutnya, konstruksi gen pengkode Bann-RBD pada vektor ekspresi pPICZ?A untuk sistem ekspresi P. pastoris X-33. Selanjutnya dilakukan optimasi produksi, produksi protein, dan pemurnian protein Bann-RBD rekombinan menggunakan teknik kromatografi afinitas dengan resin Ni-NTA. Karakterisasi biokimia dan biofisika yang dilakukan meliputi analisis SDS-PAGE, analisis deglikosilasi dengan enzim Endo-Hf, penentuan urutan asam amino dan analisis glikopeptida menggunakan LC-MS/MS. Berikutnya penentuan ukuran molekul protein Bann-RBD multimer menggunakan DLS dan TEM. Selanjutnya dilakukan studi antigenisitas untuk mengetahui interaksi protein Bann-RBD dengan antibodi spesifik. Studi imunogenisitas dilakukan dengan penyuntikan protein Bann RBD dengan dan tanpa penambahan adjuvan Alum-CpG kepada mencit BALB/c sebanyak tiga kali dengan interval 21 hari. Studi awal toksisitas protein Bann-RBD dilakukan secara in silico dan dilanjutkan dengan pengamatan berat badan, suhu, dan lokasi penyuntikan vaksin. Respon imun dari serum mencit dianalisis dengen ELISA indirect dan dilakukan uji netralisasi dengan ELISA kompetitif. Pemodelan molekul protein menunjukkan struktur Bann-RBD 60-mer dengan Bann berada pada bagian dalam dan RBD ditampilkan pada bagian luar protein multimer. Model protein ini menampilkan antigen RBD secara berulang pada bagian luar protein menyerupai infeksi alami untuk memaksimalkan respon imun. Analisis prediksi epitop terhadap reseptor sel B menunjukkan tujuh epitop yang tiga diantaranya berada pada bagian luar protein Bann-RBD multimer yaitu memiliki urutan asam amino VIAWNSNNLDSKVG, ERDISTEIYQAGSKPCNGVEGF, and GFQPTNGVGYQPYR. Analisis prediksi epitop terhadap reseptor sel T menghasilkan 22 epitop yang dapat berikatan dengan MHC I dan lima epitop yang dapat berikatan dengan MHC II. Rancangan fusi gen pengkode Bann dan RBD diinsersikan pada vektor ekspresi pPICZ?A. Protein Bann-RBD berhasil diekspresikan pada P. pastoris X-33, telah didapatkan kondisi produksi yang optimum, dan telah dimurnikan. Ukuran protein Bann-RBD berdasarkan analisis SDS-PAGE sekitar 45 kDa yang merupakan protein Bann-RBD monomer terglikosilasi. Analisis penentuan urutan peptida menggunakan LC-MS/MS dapat mengonfirmasi urutan asam amino Bann-RBD yang diekspresikan oleh P. pastoris X-33 sesuai dengan rancangan protein. Analisis deglikosilasi dengan pemotongan glikan menggunakan enzim Endo-Hf menghasilkan protein Bann-RBD berukuran sekitar 28 kDa yang mendekati berat molekul teoretisnya. Analisis glikopeptida menggunakan LC-MS/MS menunjukkan adanya tiga macam N glikopeptida yang terikat pada Asn343 pada urutan protein RBD, yaitu oligomannosa HexNAc(2)Hex(4-12), serta glikan terfosforilasi HexNAc(2)Hex(6-12)Phospho(1) dan HexNAc(2)Hex(7-13)Phospho(2) yang sesuai dengan glikan yang umum ditemukan pada protein rekombinan dari P. pastoris. Protein Bann-RBD diamati dapat membentuk protein Bann-RBD multimer secara spontan dengan diameter sekitar 50 nm yang diketahui melalui analisis DLS dan dikonfirmasi dengan pengamatan TEM. Studi antigenisitas menunjukkan protein Bann-RBD murni dikenali sangat kuat oleh antibodi IgG manusia anti-spike S1 SARS CoV-2 dibandingkan dengan protein RBD yang tidak dimodifikasi. Studi awal toksisitas menunjukkan bahwa protein Bann-RBD tidak bersifat toksik, penyuntikan protein Bann-RBD tidak menyebabkan demam, tidak ada penurunan berat badan mencit yang signifikan, dan tidak ada respon edema maupun eritema pada lokasi penyuntikan. Studi immunogenisitas menunjukkan bahwa penyuntikan Bann-RBD dengan penambahan adjuvan Alum-CpG dapat meningkatkan respon imun humoral mencit BALB/c secara signifikan dengan minimal dua kali penyuntikan dalam selang waktu 21 hari. Antibodi yang dihasilkan memiliki interaksi yang sangat kuat dengan antigen S1-spike SARS-CoV-2. Uji netralisasi secara in vitro menggunakan competitive enzyme immunoassay menunjukkan serum mencit yang divaksinasi dengan protein Bann-RBD-Alum-CpG dapat menginduksi pembentukkan antibodi netralisasi yang potensial terhadap SARS-CoV-2. Pengembangan protein Bann-RBD multimer yang diekspresikan pada P. pastoris X-33 ini merupakan kandidat yang potensial untuk pengembangan vaksin COVID-19.