Perpustakaan Digital ITB

Haloasam dehalogenase (HAD) merupakan salah satu superfamili enzim terbesar yang terdiri dari beberapa kelas enzim dengan hidrolase sebagai kelas yang paling dominan. HAD hidrolase terdiri atas subkelas fosfatase dan dehalogenase, masing masing mengatalisis reaksi hidrolisis gugus fosfat dan gugus halogen dari substrat. L-2-haloasam dehalogenase (L-2-HAD) merupakan satu-satunya anggota HAD subkelas dehalogenase yang telah banyak dipelajari dan telah berhasil dikarakterisasi dari beberapa spesies bakteri lokal. Aplikasi utama L-2-HAD adalah untuk bioremediasi senyawa haloasam rantai pendek, salah satunya adalah asam monokloroasetat (MCA). Di lain pihak, HAD fosfatase dari bakteri lokal belum pernah dikarakterisasi. HAD fosfatase dapat digunakan dalam sistem multi enzim untuk biokonversi glukosa menjadi berbagai gula langka (rare sugar) seperti silitol, tagatosa, dan allulosa. Ketiga monosakarida tersebut merupakan pemanis rendah kalori untuk menurunkan insiden obesitas, hiperlipidemia, hipertensi, dan diabetes. Penelitian sebelumnya telah berhasil mengkarakterisasi enzim HAD Bcfd1 dari B. cereus Indb1 yang memiliki aktivitas dehalogenase terhadap MCA. Analisis struktur menunjukkan Bcfd1 memiliki kemiripan dengan HAD fosfatase PDB 1NRW dari B. subtilis, sehingga diduga Bcfd1 juga memiliki aktivitas fosfatase dan merupakan HAD fosfatase. Namun, superposisi Bcfd1 dengan HAD fosfatase PDB 1NRW menunjukkan Bcfd1 kehilangan beberapa residu di ujung-N yang membentuk struktur ?-sheet. Pensejajaran residu asam amino Bcfd1 dengan beberapa HAD fosfatase lain juga menunjukkan bahwa Bcfd1 kehilangan tujuh residu penting di ujung-N, termasuk Asp7 yang merupakan residu katalitik HAD fosfatase. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan kloning gen hadbc dan konstruksi gen hadbc7 dari B. cereus ITB1. Gen hadbc7 mengkode Hadbc dengan tambahan tujuh residu asam amino di ujung-N (Hadbc7) untuk mengevaluasi pengaruh segmen tersebut terhadap aktivitas fosfatase. Penelitian dimulai dengan melakukan isolasi DNA kromosom B. cereus ITB1. Spesies bakteri yang digunakan dikonfirmasi menggunakan metode ribosomal DNA typing dengan mengamplifikasi dan menentukan urutan basa gen 16S rRNA. Setelah spesies bakteri terkonfirmasi merupakan B. cereus, primer didesain untuk amplifikasi gen hadbc dan hadbc7 menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Gen hadbc diamplifikasi dengan primer Fr (5’-GCAGAATTCATGGATGGAACACTACTAT C-3’) dan Rv (5’-GCGAAGCTTTTATTTACTAGATGAAGTTT-3’), sedangkan gen hadbc7 diamplifikasi dengan primer Fr7 (5’-CATATGAAATTAATCGCATTA GAT-3’) dan Rv. Primer Fr7 akan menempel pada urutan DNA kromosom 21 basa lebih upstream dari penempelan primer Fr sehingga Hadbc7 akan membawa tambahan tujuh residu asam amino di ujung-N. Gen hadbc dan hadbc7 selanjutnya diklon ke pGEM-T dengan sel inang E. coli TOP10 untuk perbanyak dan disubklon ke pET-30a dengan sel inang E. coli BL21(DE3) untuk ekspresi. Konfirmasi keberadan plasmid rekombinan di masing-masing sel inang dilakukan dengan PCR koloni, isolasi plasmid rekombinan, dan analisis restriksi. Selanjutnya ekspresi gen hadbc dan gen hadbc7 dalam sel inang E. coli BL21(DE3) akan memberikan ekstrak kasar enzim Hadbc dan Hadbc7. Ekstrak kasar kedua enzim tersebut digunakan untuk menentukan aktivitas fosfatase menggunakan substrat p-nitrofenil fosfat (pNPP) dan adenosin monofosfat (AMP) serta aktivitas dehalogenase menggunakan substrat MCA. Urutan gen hadbc dan gen hadbc7 ditentukan menggunakan metode Sanger. Urutan gen yang diperoleh digunakan untuk mendeduksi urutan asam amino Hadbc dan Hadbc7 serta memprediksi struktur tiga dimensinya. Stabilitas substrat pNPP, AMP, dan MCA dalam situs katalitik Hadbc7 dipelajari melalui studi komputasi penambatan molekul (docking) dan simulasi dinamika molekul (MD). Hasil analisis ribosomal DNA typing menunjukkan bahwa spesies bakteri yang digunakan memiliki kekerabatan terdekat dengan B. cereus strain LP13_RH08. Gen hadbc dan hadbc7 masing-masing memiliki ukuran 852 bp dan 873 bp. Protein Hadbc dan Hadbc7 di dalam ekstrak kasar enzim masing masing memiliki ukuran ~39 kDa dan ~33 kDa. Hadbc memiliki ukuran yang lebih besar karena membawa residu tambahan His-tag, S-tag, thrombin site, dan enterokinase site. Hadbc dan Hadbc7 memiliki aktivitas dehalogenase yang sangat rendah, tetapi keduanya memiliki aktivitas fosfatase yang tinggi. Hadbc7 memiliki aktivitas spesifik fosfatase yang jauh lebih tinggi dibandingkan Habdc. Aktivitas spesifik fosfatase Hadbc dan Hadbc7 masing-masing adalah 0,0051 ± 0,0034 U/mg dan 0,0496 ± 0,0183 U/mg pada 30 oC dan pH 5 untuk substrat pNPP, serta 0,0023 ± 0,0018 U/mg dan 0,0271 ± 0,0113 U/mg pada 30 oC dan pH 7 untuk substrat AMP. Hasil ini menunjukkan bahwa penambahan tujuh residu asam amino di ujung-N berperan penting pada aktivitas fosfatase. Hadbc7 termasuk fosfatase yang bergantung pada kofaktor ion magnesium (Mg2+). Tanpa penambahan ion Mg2+, aktivitas spesifik fosfatase Hadbc7 hanya 12,6% dibandingkan dengan penambahan 5 mM ion Mg2+. Simulasi MD mendukung hasil uji aktivitas dengan substrat pNPP dan AMP memiliki stabilitas yang lebih tinggi dibandingkan substrat MCA selama simulasi MD. Ion Mg2+ berperan dalam menjaga stabilitas dan orientasi substrat terlihat dari nilai energi bebas pengikatan yang berkontribusi paling besar. Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa Hadbc dan Hadbc7 dari B. cereus ITB1 merupakan enzim HAD subkelas fosfatase.