Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (1,4-?-D-glukan-glukanohidrolase, EC 3.2.1.1) adalah enzim yang menghidrolisis ikatan ?-1,4 glikosidik dari bagian dalam molekul pati menghasilkan oligosakarida rantai lurus atau bercabang. Struktur ?-amilase terdiri dari tiga domain utama, yaitu domain A sebagai katalitik, domain B yang berperan dalam pengikatan ion Ca²?, serta domain C yang berfungsi sebagai penstabil domain katalitik. Berdasarkan kemiripan urutan asam amino penyusunnya, ? amilase diklasifikasikan ke dalam keluarga Glikosil Hidrolase 13 (GH13). Keluarga GH13 terbagi menjadi 47 sub-keluarga berdasarkan kesamaan residu lestari, jenis substrat, dan produk hasil hidrolisis. Sub-keluarga GH13_45 memiliki tiga ciri utama, yaitu pasangan residu triptofan di antara daerah lestari (Conserved Sequence Residue) CSR-V dan CSR-II, motif lestari LPDlx (leusin, prolin, asam aspartat, leusin, dan residu asam amino apapun) pada CSR-V, serta lima asam amino aromatik di ujung domain C. Beberapa anggota sub-keluarga GH 13_45 diketahui memiliki ujung domain C yang bersifat hidrofobik, yaitu pada ?-amilase ASKA dari Anoxybacillus SK3-4, GTA dari G. thermoleovorans CCB_US3_UF5, BaqA dari B. aquimaris MKSC 6.2 dan BmaN1 dari B. megaterium NL3. ?-Amilase BaqA adalah salah satu anggota sub-keluarga GH13_45 yang dapat menghidrolisis pati melalui residu aromatik yang diduga berperan sebagai pengikat pati permukaan (surface binding site, SBS). BaqA memiliki residu aromatik yang menyerupai SBS pada isozim AMY1 dari ? amilase barley. AMY1 memiliki dua SBS, yaitu SBS1 yang terdiri dari residu triptofan-278 dan triptofan-279 yang terletak di permukaan domain A, dan SBS2 yaitu residu tirosin-380 yang terletak di domain C. Dalam konteks BaqA, pasangan residu triptofan-201 dan triptofan-202 yang berada di domain A menyerupai SBS1 pada AMY1. Selain itu, BaqA memiliki residu tirosin-400 yang terletak di domain C dengan orientasi mengarah ke permukaan protein. Posisi ini menjadikan tirosin-400 sebagai kandidat SBS di domain C BaqA, serupa dengan peran residu tirosin-380 pada AMY1 sebagai SBS2. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis peran ujung C, residu triptofan-201 dan tirosin-400 pada BaqA dalam pengikatan pati. Tujuan tersebut dicapai melalui pendekatan eksperimen dan bioinformatika. Pendekatan eksperimen yang dilakukan berupa ekspresi, pemurnian dan karakterisasi sifat fisiko-kimia pada BaqA?C dan BaqA?C_W201A. Selain itu, dilakukan mutasi terarah pada residu tirosin-400 menjadi alanin, serin dan triptofan menjadi BaqA?C_Y400A, BaqA?C_Y400S dan BaqA?C_Y400W, ekspresi protein serta uji aktivitas ekstrak kasar protein pada BaqA?C dan varian mutan ujung C. Pendekatan bioinformatika yang dilakukan berupa simulasi penambatan molekul dan simulasi dinamika molekul pada keseluruhan protein uji. BaqA?C diekspresikan di E. coli ArcticExpress (DE3) menghasilkan protein dengan berat molekul ~60 kDa. BaqA?C memiliki aktivitas optimum pada suhu 50 °C, pH 6,5 dan konsentrasi NaCl 500 mM. BaqA?C memiliki sifat halotoleran yang dapat mempertahankan aktivitasnya sampai dengan 60% pada konsentrasi NaCl 1,5 M. Stabilitas BaqA?C terjaga hingga 6 jam setelah preinkubasi pada suhu 50 °C. BaqA?C dapat menghidrolisis pati terlarut dengan aktivitas spesifik sebesar 6,4 U/mg, serta dapat menghidrolisis pati mentah jagung dan singkong menghasilkan gula pereduksi masing-masing sebesar 2,7 dan 3,1 mM, yang setara dengan Derajat Hidrolisis (DH) masing-masing 1,1% dan 1,3%. Parameter kinetika enzim menunjukkan bahwa BaqA?C efektif bekerja pada konsentrasi substrat yang tinggi, dengan nilai Km 36,24 mg.mL?1, Vmax 103,5 µg.min?1, kcat 412 s?1 dan kcat/Km 11,4 mL.mg?1 s?1. Berdasarkan keseluruhan hasil tersebut diketahui bahwa pemotongan 34 residu asam amino di ujung C menyebabkan perubahan pH dan suhu optimum, meningkatnya jumlah gula pereduksi yang dihasilkan dari hidrolisis berbagai jenis pati, serta meningkatnya stabilitas, sifat halotoleran, dan nilai parameter kinetika pada BaqA?C dibandingkan dengan BaqA yang telah diuji sebelumnya. Ekspresi BaqA?C_W201A di E. coli ArcticExpress (DE3) menghasilkan protein dengan berat molekul ~58 kDa. Aktivitas spesifik hidrolisis pati terlarut oleh BaqA?C_W201A adalah 4,5 U/mg. Parameter kinetika BaqA?C_W201A menunjukkan nilai Km 55,9 mg.mL?1, Vmax 157 µg min?1, kcat 668 s?1 dan kcat/Km 11,9 mL.mg?1 s?1 pada substrat pati terlarut. BaqA?C_W201A mampu menghidrolisis pati mentah jagung dan singkong, menghasilkan gula pereduksi sebesar 1,61 mM (0,72% DH) pada pati jagung dan 0,9 mM (0,4% DH) pada pati singkong. Hasil pemindaian mikroskop elektron (Scanning Electron Microscope, SEM) menunjukkan bahwa permukaan pati jagung dan pati singkong hasil hidrolisis BaqA?C_W201A memiliki jumlah pori dan/atau pengelupasan yang lebih sedikit dibandingkan dengan hasil hidrolisis oleh BaqA?C. Hal tersebut menunjukkan penurunan efektivitas hidrolisis pati mentah oleh BaqA?C_W201A dibandingkan dengan hidrolisis pati mentah oleh BaqA?C. Penuruan aktivitas tersebut didukung oleh perubahan komposisi struktur sekunder yang dianalisis menggunakan dikroisme sirkular (Circullar Dichrosim, CD) menunjukkan bahwa BaqA?C memiliki komposisi ?-heliks, ?-lembar dan ?-turn (belok) masing-masing sebesar 16,8, 37,2 dan 32%. Sementara itu, pada BaqA?C_W201A komposisi tersebut berubah menjadi 5,2, 34,8 dan 14,5% untuk struktur sekunder ?-heliks, ?-lembar dan ?-belok. Hasil simulasi dinamika molekul menunjukkan bahwa pengikatan ligan pada sisi aktif BaqA?C_W201A menyebabkan perubahan orientasi ligan dan memengaruhi fleksibilitas residu tirosin-179 di daerah sisi aktif. Hal tersebut terkonfirmasi melalui analisis fluktuasi kuadrat rata rata (Root Mean Square Fluctuation, RMSF). Selain itu, mutasi residu triptofan-201 meningkatkan jarak ikatan hidrogen antara tirosin-179 dan akarbosa yang berdampak pada penurunan stabilitas interaksi ligan. Hasil analisis molecular mechanics generalized Born surface area (MM-GBSA) menunjukkan bahwa BaqA?C memiliki afinitas yang lebih kuat dengan akarbosa dibandingkan dengan afinitas antara BaqA?C_W201A. Hal tersebut terlihat dari nilai afinitas BaqA?C yang lebih negatif, yaitu sebesar ?8,8 kkal/mol dibandingkan dengan afinitas BaqA?C_W201A terhadap akarbosa, yaitu sebesar ?7,9 kkal/mol. Penurunan afinitas tersebut konsisten dengan hasil uji eksperimen, yang menunjukkan bahwa mutasi residu triptofan-201 menyebabkan penurunan aktivitas hidrolisis BaqA?C_W201A pada berbagai jenis pati. Residu pengikat pati pada domain C BaqA?C diidentifikasi melalui analisis rongga pada model struktur BaqA?C dan penjajaran residu lestari di ujung domain C dari anggota sub-keluarga GH13_45. Analisis rongga pengikatan ligan menggunakan perangkat daring POCASA mengungkapkan keberadaan rongga pengikatan ligan pada domain C dengan volume terbesar kedua (222 Å3), setelah rongga pada domain A yang memiliki volume 439 Å3. Penjajaran urutan asam amino anggota sub-keluarga GH13_45 menunjukkan bahwa residu tirosin-400 pada BaqA merupakan residu lestari di sub-keluarga ini. Hasil analisis kajian awal residu tirosin-400 sebagai pengikat pati di domain C melalui simulasi dinamika molekul menunjukkan bahwa mutasi residu tirosin-400 menjadi triptofan pada BaqA?C_Y400W pada keadaan tanpa akarbosa meningkatkan fleksibilitas residu 161–179 dan 318–325 di domain A yang membentuk struktur lengkungan dan ?-heliks. Secara energetika, mutasi tirosin-400 menjadi triptofan meningkatkan stabilitas interaksi dengan akarbosa yang terikat pada domain C, seperti ditunjukkan oleh hasil analisis MM-GBSA BaqA?C_Y400W, yaitu sebesar ?24,45 kkal/mol. Nilai tersebut menunjukkan afinitas akarbosa yang lebih baik pada BaqA?C_Y400W dibandingkan dengan BaqA?C, yang memiliki nilai ?G sebesar ?23,24 kkal/mol. Secara eksperimen, mutasi terarah dilakukan pada residu tirosin-400 dengan mengganti nukleotida 5’-TAT-3’, yang mengkode tirosin-400 pada posisi nukleotida ke-1198 hingga 1200 dalam gen baqA?C, menjadi nukleotida 5’-CGC-3’, 5’-AGC-3’, dan 5’-ACC-3’, masing-masing mengkode alanin, serin, dan triptofan. Mutasi tersebut menghasilkan varian BaqA?C_Y400A, BaqA?C_Y400S, dan BaqA?C_Y400W. Ekspresi ketiga mutan tersebut dalam E. coli ArcticExpress (DE3) menghasilkan protein dengan berat molekul ~58 kDa. Hasil pengujian aktivitas ekstrak kasar menunjukkan bahwa protein BaqA?C memiliki aktivitas spesifik terhadap pati terlarut sebesar 3,6 U/mg, yang tidak berbeda signifikan dengan BaqA?C_Y400A (3,9 U/mg). Aktivitas spesifik meningkat secara signifikan pada BaqA?C_Y400W menjadi 6,8 U/mg, sedangkan mutasi menjadi serin pada BaqA?C_Y400S menyebabkan penurunan aktivitas menjadi 2,3 U/mg. Peningkatan aktivitas spesifik pada BaqA?C_Y400W konsisten dengan hasil simulasi dinamika molekul yang menunjukkan bahwa interaksi BaqA?C_Y400W dengan akarbosa lebih stabil dibandingkan mutan lainnya. Hal tersebut diduga dipengaruhi oleh perubahan fleksibilitas residu di domain katalitik yang terjadi akibat mutasi tirosin-400 menjadi triptofan. Ujung C pada BaqA berpengaruh terhadap stabilitas dan sifat halotoleran. BaqA?C menunjukkan sifat tahan garam dan stabilitas yang lebih baik dibandingkan BaqA. Residu triptofan-201 di domain A pada BaqA?C berperan dalam pengikatan pati. Selain itu, mutasi residu tersebut menjadi alanin memengaruhi residu di sekitar sisi aktif, terutama tirosin-179, dan meningkatkan jarak ikatan dengan substrat, sehingga diduga turut berperan dalam menurunkan aktivitas hidrolisis. Sementara itu, mutasi residu tirosin-400 pada BaqA?C memengaruhi fleksibilitas residu-residu di domain A. Mutasi tirosin-400 menjadi triptofan meningkatkan fleksibilitas residu di domain katalitik, yang diduga berperan pada peningkatan aktivitas hidrolisis BaqA?C_Y400W. Penelitian lebih lanjut melalui kristalisasi diharapkan dapat memberikan pemahaman yang lebih mendalam mengenai interaksi antara pati dan residu pengikat pati pada BaqA?C. Selain itu, peran residu tirosin-179 pada sisi aktif dapat dikaji lebih lanjut melalui pendekatan mutasi terarah, ekspresi, pemurnian, dan analisis sifat fisiko-kimia.