Perpustakaan Digital ITB

Saat ini, potensi penggunaan peptida bioaktif banyak dieksplorasi untuk diaplikasikan di berbagai bidang, termasuk di bidang farmasi. Salah satu strategi penemuan peptida bioaktif adalah pemecahan dari protein utuh yang memberikan efek terapi. Albumin dilaporkan mampu menekan aktivitas angiotensin-converting enzyme (ACE) pada renin-angiotensin system (RAS) dalam meregulasi tekanan darah. ACE inhibitor (ACEI) merupakan salah satu kelompok obat yang digunakan sebagai lini utama pengobatan hipertensi. Namun, penggunaan obat kimia dari kelompok ACEI dilaporkan menimbulkan efek samping. Ikan gabus (Channa striata) merupakan jenis ikan konsumsi kaya albumin yang banyak digunakan sebagai obat tradisional. Albumin merupakan protein terbanyak yang ditemukan pada C. striata dan dilaporkan memiliki aktivitas sebagai ACEI alami. Peptida hasil pemecahan albumin C. striata dihipotesiskan memiliki aktivitas antihipertensi alami dengan profil keamanan dan khasiat yang baik serta memberikan nilai tambah bagi pemanfaatan C. striata. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan kandidat antihipertensi alami berupa peptida melalui pendekatan pemecahan albumin dari C. striata. Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahapan besar. Pertama, fraksinasi peptida dari albumin C. striata. Albumin dipisahkan dari ekstrak C. striata dengan metode Chon Process yang dimodifikasi. Pemecahan albumin dilakukan secara enzimatis untuk menghasilkan peptida. Selanjutnya, peptida albumin difraksinasi berdasarkan ukuran. Tahap kedua, karakterisasi dari fraksi peptida albumin. Proses karakterisasi dilakukan dengan menggunakan metode KLT dan LCMS. Ketiga, uji bioaktivitas fraksi peptida albumin sebagai ACEI. Penapisan aktivitas ACEI dilakukan dengan mengevaluasi persen penghambatan ACE untuk mendapatkan fraksi peptida albumin yang paling potensial. Selanjutnya, konfirmasi aktivitas fraksi peptida dilakukan di lini sel HDF dan sel kardiomiosit primer tikus dengan mengevaluasi produksi Ang-II, EDN1, dan NO menggunakan kit ELISA dan activity assay. Fraksinasi protein dari ekstrak C. striata menghasilkan 5 fraksi protein yang disebut sebagai Fraksi-1 hingga Fraksi-5. Albumin C. striata akan terkonsentrasi pada Fraksi-5. Ekstrak C. striata yang digunakan sebagai bahan baku disebut sebagai Fraksi Parental. Hasil fraksinasi protein menghasilkan Fraksi-5 dengan berat kering 3,8 ± 2,1 %. Evaluasi UVmax menunjukkan serapan maksimum dari Fraksi-5 adalah 280-290 nm. Hasil ini mengindikasikan protein dalam Fraksi-5 memiliki kemurnian yang baik. Hasil trisin-SDS PAGE dari Fraksi-5 menunjukkan adanya dua pita protein berukuran ± 10 dan 13 kDa. Dua protein tersebut diperkirakan adalah albumin C. striata. Selanjutnya, Fraksi-5 dipecah menggunakan alkalase dan pepsin. Fraksi peptida yang didapat kemudian diultrafiltrasi untuk menghasilkan fraksi peptida berukuran > 10 kDa, 3-10 kDa dan < 3 kDa. Kajian bioaktivitas menunjukkan adanya kecenderungan peningkatan aktivitas ACEI seiring proses fraksinasi, dimana Fraksi-5 menunjukkan penghambatan sebesar 22,99 ± 4,36 %. Proses penapisan aktivitas ACEI dari fraksi-fraksi peptida yang dihasilkan dari Fraksi-5 menunjukkan aktivitas terbesar ditemukan pada fraksi peptida < 3 kDa dari pemecahan enzimatis menggunakan alkalase (FPA), yaitu 56,65 ± 2,32 %. Aktivitas tersebut berbeda signifikan secara statistik terhadap Fraksi Parental (p<0,01) dan Fraksi-5 (p<0,05). Nilai IC50 ACEI dari FPA adalah 36,93 ?g/mL, tidak jauh berbeda dengan Kaptopril (32,66 %) yang digunakan sebagai kontrol. Kajian dose response menunjukkan FPA dan Kaptopril memiliki dosis optimum yang sama, yaitu 72,5 ?g/mL. Hasil penapisan mengindikasikan bahwa FPA merupakan kandidat peptida ACEI yang paling baik untuk dilanjutkan ke tahap penelitian selanjutnya. Karakterisasi FPA dengan teknik KLT menunjukkan setidaknya ada 4 peptida utama yang terdeteksi dengan nilai Rf 0,34; 0,43; 0,54; dan 0,64. Selain itu, hasil LCMS juga menunjukkan 4 peptida utama dengan nilai m/z 460,27; 500,96; 530,31; dan 644,05. Meskipun menunjukan jumlah peptida yang sama, peptida yang ditemukan pada KLT dan LCMS tidak dapat dikorelasikan secara langsung karena menggunakan fase gerak dan diam yang berbeda. Berdasarkan hasil ini dapat disimpulkan bahwa fraksi yang mengandung keempat peptida tersebut terlibat dalam aktivitas ACEI dari FPA. Pengujian aktivitas ACEI lebih lanjut di lini sel HDF dan sel kardiomiosit primer tikus menunjukkan bahwa FPA memodulasi RAS secara dose-dependent melalui penekanan Ang-II (hingga 25,68 %, p<0,05) dan peningkatkan NO (hingga 79,66 %, p<0,01). Hasil ini mengindikasikan potensi aktivitas FPA dalam menghambat aktivasi RAS oleh etanol di lini sel HDF dan sel kardiomiosit primer tikus. Meskipun hasil positif di kajian in vivo dan klinis masih diperlukan, hasil penelitian ini memperlihatkan bukti ilmiah dari FPA sebagai salah satu kandidat antihipertensi alami potensial untuk penanganan hipertensi dan kondisi lain yang berhubungan dengan overaktivasi RAS. Kajian orientasi upscaling dilakukan untuk meningkatkan kapasitas produksi FPA dari skala lab ke pilot. Hasil KLT menunjukkan tidak ada perbedaan karakteristik peptida dari kedua skala, yaitu terdeteksinya empat peptida utama. Hasil perbandingan uji aktivitas juga menunjukkan tidak ada perbedaan signifikan dari FPA skala lab dan pilot. Selain itu, upaya pengembangan EIGH sebagai fraksi peptida ACEI dari C. striata dengan biaya produksi yang lebih rendah juga telah dilakukan dengan menghilangkan tahapan fraksinasi protein. Empat varian EIGH dikembangkan berdasarkan penggunaan bahan baku dan enzim yang berbeda. Di antara varian EIGH yang diujikan, EIGH1 menunjukkan aktivitas ACEI terbesar, yaitu sebesar 31,71 ± 3,08 %. Selanjutnya, ultrafiltrasi EIGH1 akan dilakukan untuk mendapatkan fraksi peptida berukuran < 3 kDa. Fraksi ini diperkirakan memiliki aktivitas ACEI yang lebih baik untuk selanjutnya dikembangkan sebagai pengganti FPA.