Perpustakaan Digital ITB

Polietilena tereftalat (PET) adalah jenis plastik yang umum digunakan dalam berbagai sektor industri. Akumulasi limbah PET di lingkungan menimbulkan risiko kesehatan bagi makhluk hidup dan menambah masalah ekologi. Salah satu strategi utama untuk mengatasi akumulasi limbah PET adalah pengembangan metode biodegradasi enzimatik, yang memecah polimer PET menjadi monomer seperti MHET, BHET, asam tereftalat, dan etilen glikol. Penelitian ini bertujuan untuk menguji enzim PETase yang telah mengalami mutasi pada residu asam amino di titik L117F / Q119Y / S121E / G165A / D186H / R280A / S214H / S238F untuk meningkatkan termostabilitas serta afinitas enzim terhadap substrat PET. Optimasi ekspresi enzim PETase mutan pada inang E. coli BL21(DE3) telah dilakukan dalam skala laboratorium pada penelitian sebelumnya dan pada penelitian ini skala produksi ditingkatkan dengan volume kultur 150 mL dan 1 L. Kultur stok E. coli BL21(DE3) transforman ditumbuhkan pada media padat LB dan konfirmasi koloni dilakukan melalui metode PCR koloni. Enzim PETase mutan diproduksi pada kultur volume 150 mL menggunakan IPTG 0,25 mM pada suhu ± 30°C selama 24 jam dengan agitasi 150 rpm, dan pada kultur volume 1 L menggunakan bioreaktor dengan parameter yang sama serta aerasi 1,5 vvm. Sampel diambil pada jam ke-8, 12, 18, dan 24 selama proses fermentasi. Semua sampel kemudian dipurifikasi menggunakan kolom Ni-NTA dan dianalisis melalui SDS-PAGE serta western blot. Aktivitas enzim PETase mutan diuji menggunakan substrat p-NPB dan polimer PET pada suhu 50°C dan pH 9. Hasil elektroforesis mengkonfirmasi keberadaan plasmid pET22b(+) dengan gen PETase mutan berukuran 1210 bp. Ekspresi enzim PETase mutan pada kultur volume 150 mL menghasilkan protein berukuran 30,7 kDa, sementara pada kultur volume 1 L menghasilkan protein mendekati 40 kDa, sesuai dengan visualisasi SDS-PAGE dan western blot. Uji aktivitas menunjukkan bahwa pada enzim crude, durasi dan volume kultur mempengaruhi konsentrasi asam tereftalat dan aktivitas enzim, dengan nilai tertinggi pada hari ke-7 masing-masing sebesar 138,03 ppm dan 140 ppm serta persentase aktivitas 41,46% dan 42,174%. Pada enzim murni freeze-dried, konsentrasi tertinggi mencapai 140,8 ppm dan 143,94 ppm dengan persentase aktivitas 42,2% dan 43,1%. Inkubasi PET dengan enzim PETase murni terkonsentrat menunjukkan bahwa hanya durasi inkubasi yang secara signifikan mempengaruhi konsentrasi asam tereftalat, dengan nilai tertinggi masing-masing sebesar 145,14 ppm dan 145,59 ppm serta persentase aktivitas 43,54% dan 43,67% untuk kedua volume kultur. Kesimpulan dari penelitian ini adalah enzim PETase mutan dapat diekspresikan baik dalam skala lebih besar dengan perbedaan karakteristik yang minimal. Durasi inkubasi secara signifikan berpengaruh terhadap konsentrasi asam tereftalat yang dihasilkan, kecuali pada enzim murni freeze-dried. Enzim dari volume kultur berbeda menunjukkan konsentrasi asam tereftalat dengan perbedaan signifikan kecuali pada sampel yang diinkubasi dengan enzim murni terkonsentrat. Penelitian lebih lanjut diharapkan dapat dilakukan untuk mengoptimasi parameter produksi pada skala 1 L seperti pH, aerasi, dan waktu inkubasi untuk mendapatkan yield 4 enzim PETase mutan yang maksimal dan juga dilakukan karakterisasi enzim lebih lanjut untuk mengetahui kesesuaian struktur enzim PETase mutan yang dihasilkan.