Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RT) merupakan enzim yang memiliki kemampuan untuk mengubah rantai RNA menjadi rantai DNA yang banyak dibutuhkan dalam bidang molekuler. Untuk meningkatkan prosesivitas dan termostabilitas dari RT, pada penelitian sebelumnya telah dilakukan rekayasa dengan melakukan fusi Sis7a pada MMLV reverse transcriptase. Namun, sampai saat ini belum dilakukan optimasi terhadap buffer reaksi maupun buffer penyimpanan dari RT fusi Sis7a. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi buffer reaksi dan penyimpanan dari RTase fusi Sis7a untuk mengoptimalkan aktivitas serta stabilitasnya. Pengujian dilakukan dengan menggunakan variasi terhadap komponen larutan penyangga reaksi dan penyimpanan selama 3 bulan dengan variasi penyimpanan pada temperatur -20°C, 4°C dan suhu ruang (~25°C). Pada buffer reaksi, variasi dilakukan pada konsentrasi MgCl2 2.5 mM, 3 mM dan 3.5 mM, sedangkan pada buffer penyimpanan variasi dilakukan pada konsentrasi DTT 2.5 mM, 5 mM dan 7.5 mM. Parameter dari pengujian berupa aktivitas reverse transcription yang diukur berdasarkan kemampuan enzim dalam menginkorporasi nukleotida dalam pembentukan cDNA. Enzim yang digunakan dalam penelitian ini diproduksi dalam skala 80 mL dengan menggunakan metode yang telah dioptimasi pada penelitian sebelumnya. Konfirmasi keberadaan plasmid ekspresi pada isolat dilakukan dengan PCR dan elektroforesis dengan target gen T7. Konfirmasi hasil protein pada proses panen, purifikasi dan konsentrat dilakukan dengan menggunakan SDS-PAGE. Dari hasil penelitian diperoleh aktivitas tertinggi pada buffer reaksi yaitu pada konsentrasi MgCl2 3 mM dan buffer penyimpanan dengan konsentrasi DTT 7.5 mM. Dari penelitian ini juga didapatkan suhu penyimpanan -20°C memberikan hasil aktivitas terbaik pada berbagai konsentrasi setelah 3 bulan penyimpanan. Dari penelitian ini, diperoleh komponen optimum buffer reaksi dan buffer penyimpanan serta suhu penyimpanan optimum dari RT fusi Sis7a yang dapat mendukung pengaplikasian enzim ini.