Radikal bebas merupakan senyawa yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan, sehingga cenderung sangat reaktif dan mampu merusak molekul-molekul dalam tubuh manusia. Akumulasi radikal bebas dapat menyebabkan komplikasi masalah kesehatan, seperti penuaan dini dan berbagai penyakit degeneratif. Antioksidan adalah senyawa yang mampu melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas dengan menghentikan reaksi berantai berbahaya yang dapat merusak molekul-molekul biologis penting. Tanaman daun gatal (Laportea decumana (Roxb.) Wedd.) merupakan salah satu tumbuhan yang dikenal berpotensi sebagai penghasil antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan ekstrak daun gatal dengan metode peredaman 2,2-difenil-1-pikrihidrazil (DPPH) dan mengisolasi serta mengkarakterisasi senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada daun gatal. Simplisia daun gatal diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut dengan kepolaran bertingkat (n- heksana, etil asetat, dan etanol). Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode peredaman DPPH pada panjang gelombang 517 nm dengan asam askorbat sebagai kontrol positif. Hasil uji kualitatif dan kuantitatif peredaman DPPH menunjukkan bahwa senyawa aktif antioksidan terdapat pada ekstrak n-heksana dan ekstrak etanol. Ekstrak n-heksana difraksinasi dengan metode kromatografi cair vakum (KCV), dilanjutkan subfraksinasi dengan metode kromatografi kolom klasik (KKK). Subfraksi yang mengandung senyawa target kemudian dilanjutkan ke tahap subfraksinasi 2 dengan metode Medium Pressure Liquid Chromatography (MPLC). Subfraksi yang diperoleh dimurnikan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif. Isolat diuji kemurniannya menggunakan metode KLT dengan tiga fase gerak dan KLT dua dimensi. Hasil KLT dipindai dengan KLT Spektrofotodensitometer untuk diperkirakan golongan senyawanya. Aktivitas antioksidan ekstrak daun gatal (Laportea decumana (Roxb) Wedd.) diurutkan dari yang paling kuat hingga paling lemah yaitu ekstrak etanol, ekstrak n-heksana dan ekstrak etil asetat dengan nilai IC50 berturut- turut sebesar 114,104 ± 1,263, 895,705 ± 1,734, dan > 5000 ?g/mL. Berdasarkan hasil karakterisasi dengan metode KLT Spektrofotodensitometri, diketahui bahwa isolat yang didapatkan dari ekstrak n-heksana merupakan senyawa golongan terpenoid, dengan subgolongan karotenoid. Isolat memiliki nilai persen peredaman DPPH sebesar 32,961 ± 0,227% pada konsentrasi 1000 ?g/mL.