Perpustakaan Digital ITB

Pati merupakan polisakarida yang terdiri dari amilosa dan amilopektin. Keberadaan amilosa mampu membentuk rongga hidrofobik menyebabkan pati sulit larut dalam air sehingga membutuhkan proses gelatinisasi pada temperatur di atas 60°C agar pati dapat dihidrolisis enzim. Salah satu cara untuk menghemat biaya industri adalah dengan memanfaatkan raw starch degrading amylase (RSDA) yaitu amilase yang memiliki kemampuan menghidrolisis pati mentah, tanpa tahap gelatinisasi. Bacillus megaterium NL3 isolat Danau Kakaban, Kalimantan Timur diketahui menghasilkan salah satu ?-amilase pendegradasi pati mentah, yaitu BmaN2 yang tidak memiliki domain tambahan pengikat pati, tetapi diyakini memiliki residu yang berperan dalam pengikatan pati. Studi komputasi menunjukkan bahwa residu Trp198 (W198) BmaN2 diduga memiliki peranan penting dalam pengikatan pati. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah menentukan aktivitas dan karakter biofisik residu Trp198 pada varian BmaN2 tidak dimutasi (wild type), mutan W198A, dan W198F terhadap pengikatan pati mentah dan pati terlarut. BmaN2 diproduksi di E. coli BL21 (DE3) sebagai protein terlarut. Larutan protein dimurnikan menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dan dikarakterisasi menggunakan spektrofluorometri dan uji aktivitas dengan metode DNS. Keberhasilan ekspresi BmaN2 dikonfirmasi menggunakan Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Analisis ekspresi dan pemurnian protein menggunakan SDS- PAGE menunjukkan keberadaan pita pada ukuran ~61,5 kDa yang sesuai dengan ukuran BmaN2. Uji aktivitas BmaN2 mutan murni dengan substrat pati terlarut menunjukkan defisiensi aktivitas sebesar 47% (W198A) dan 48% (W198F) terhadap wild type. Hasil karakterisasi menggunakan spektrofluorometri berdasarkan emisi triptofan terhadap wild type, BmaN2 W198A, dan W198F menunjukkan bahwa struktur ketiganya tidak mengalami perubahan yang signifikan. Hal ini ditandai dengan puncak spektrum yang relatif sama, yaitu berada pada panjang gelombang 340 nm. Namun, spektrum fluoresensi menunjukkan adanya penurunan intensitas emisi pada BmaN2 W198A dan W198F terhadap wild type yang menandakan peningkatan fleksibilitas triptofan. Selain itu, adanya penambahan larutan pati menyebabkan pergeseran panjang gelombang dari 340 nm menjadi 355 nm (red-shifted), baik pada wild type maupun BmaN2 mutan yang mengindikasikan perubahan konformasi BmaN2 karena berinteraksi dengan pati. Triptofan cenderung terkubur di dalam rongga hidrofobik, tetapi ketika berinteraksi dengan pati, konformasi enzim menjadi lebih terbuka. Selain itu, analisis Circular Dichroism (CD) menunjukkan kemiripan struktur sekunder antara wild type dan mutan W198F sedangkan W198A menunjukkan struktur sekunder berbeda.