Perpustakaan Digital ITB

Pandemi Corona Virus Disease 2019 (COVID-19) merupakan penyakit yang disebabkan oleh Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 (SARS-CoV-2). Mutasi yang terjadi pada virus SARS-CoV-2 serta tingginya kebutuhan vaksin secara global, mengharuskan adanya pengembangan vaksin secara berkala. Salah satu platform vaksin yang banyak digunakan adalah vaksin berbasis protein subunit. Antibodi netralisasi yang spesifik terhadap Receptor Binding Domain (RBD) mampu memblokir pengikatan RBD pada reseptor Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2), sehingga RBD merupakan antigen yang ideal dalam proses pembuatan vaksin berbasis protein subunit. Vaksis berbasis protein S atau RBD yang ada saat ini menggunakan sel inang serangga dan mamalia. Produksi menggunakan sistem ekspresi ini membutuhkan biaya yang tinggi serta waktu yang lama. Ragi metilotropik seperti H. polymorpha dapat menjadi alternatif sistem ekspresi yang akan memberikan keuntungan seperti produksi yang cepat dengan biaya yang relatif lebih murah dan tersedianya modifikasi pasca translasi yang dibutuhkan untuk mengekspresi protein rekombinan RBD. Tujuan dari penelitian ini adalah dilakukan konstruksi H. polymorpha yang mengandung gen RBD, ekspresi protein RBD, serta karakterisasi protein yang telah diproduksi. Konstruksi plasmid dibuat melalui pendekatan mutagenesis situs terarah dengan pHIPX4-RBD-Foldon sebagai templatnya. Hasil penentuan urutan plasmid menunjukkan bahwa kodon glisin telah termutasi menjadi kodon stop. Adanya perubahan tersebut menandakan bahwa plasmid pHIPX4-RBDTAA-Foldon yang berukuran sekitar ~8 kb telah berhasil dikonstruksi dan dikloning di sel E. coli TOP10F'. Plasmid ini tetap membawa gen pengkode RBD-Foldon, namun protein foldon tidak diterjemahkan menjadi polipeptida penyusun protein foldon. Plasmid pHIPX4-RBDTAA-Foldon dilinierkan menggunakan enzim ScaI kemudian diintegrasikan ke dalam kromosom H. polymorpha. Integrasi plasmid rekombinan pHIPX4-RBDTAA-Foldon ke dalam kromosom H. polymorpha terjadi melalui rekombinasi homolog single crossover pada lokus promoter 5’MOX. Integrasi plasmid pHIPX4-RBDTAA-Foldon ke kromosom H. polymorpha NCYC495 telah berhasil dilakukan. Keberadaan fragmen DNA berukuran ~1 kb pada PCR koloni mengkonfirmasi bahwa gen RBDTAA-Foldon telah terintegrasi ke dalam kromosom H. polymorpha NCYC495 Protein RBD diekspresikan pada H. polymorpha menggunakan media BMMY yang mengandung 2% metanol selama 72 jam dengan kerapatan sel awal OD600 20 dan aerasi 10%. Gen RBD yang diinsersikan ke dalam plasmid pHIPX4 telah difusi dengan ?-mating factor prepro signal sequence (?-MF) dari Saccharomyces cerevisae sehingga protein akan disekresikan ke luar sel. Protein yang terlarut pada media selanjutnya dipekatkan dengan Tangetial Flow Ultrafiltration (TFF). Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan adanya pita pada ukuran ~23 kDa yang merupakan ukuran protein RBD. Berdasarkan Enzyme-Linked Immunosorbet Assay (ELISA) protein RBD dapat dikenali antibody mouse anti-RBD. Oleh karena itu, protein RBD SARS-CoV-2 yang diproduksi di H. polymorpha dapat menjadi kandidat vaksin COVID-19.