Perpustakaan Digital ITB

PET merupakan salah satu jenis plastik yang banyak digunakan karena sifatnya yang tahan berbagai stres fisik. Sifat ini kemudian menyebabkan PET sulit untuk didegradasi dan menjadi masalah lingkungan. Bakteri Ideonella sakaiensis ditemukan mampu menghasilkan enzim PETase yang dapat mendegradasi PET. Namun enzim ini cenderung tidak stabil pada suhu untuk pendegradasian industrial. Oleh karena itu, PETase mutan dikonstruksikan secara in silico agar menjadi PETase yang lebih stabil dan afinitas terhadap subtsrat lebih tinggi. Konstruk PETase mutan yang baru terancang ini perlu diujikan secara wet lab agar dapat diekspresikan dan didapatkan kondisi optimum untuk ekspresinya. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan durasi induksi dan konsentrasi IPTG yang optimum untuk mengekspresikan PETase mutan L117F / Q119Y / S121E / G165A / D186H / R280A / S214H / S238F pada suhu 24oC kemudian diujikan keberadaan aktivitasnya. Konstruk plasmid dirancang menggunakan plasmid PET22b(+) yang disisipkan gen PETase mutan dengan sinyal peptida pelB disematkan pada daerah upstream dan His-Tag pada daerah downstream. Plasmid ditransformasi ke host bakteri E. coli BL21(DE3) menggunakan metode heatshock kemudian keberhasilan transformasi dikonfirmasi menggunakan PCR koloni, elektroforesis, dan sekuensing DNA. Metode penentuan kondisi optimum dilakukan dengan variasi durasi inkubasi 8, 16, dan 24 jam dengan konsentrasi IPTG 0, 0.25, 0.5, dan 1 mM. Uji aktivitas dilakukan menggunakan substrat pNPB melalui pengukuran absorbansi pada ? = 405nm. Hasil PCR dan sekuensing DNA menunjukkan bahwa gen PETase, baik mutan dan wildtype, telah tertransformasikan ke dalam E. coli. Hasil analisis SDS-PAGE menunjukkan bahwa durasi induksi 24 jam dan konsentrasi IPTG 1 mM menghasilkan pita protein paling tebal diantara kondisi yang lainnya. Kombinasi ini kemudian diterapkan untuk uji aktivitas PETase mutan. Pengujian aktivitas enzimatis menunjukkan adanya aktivitas enzim PETase mutan dengan rata-rata ?absorbansi 0.33253. Berdasarkan penelitian ini dapat ditentukan ekspresi dan aktivitas dari enzim rekombinan PETase mutan. Penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk mengkarakterisasi sifat dan aktivitas enzim rekombinan tersebut.