Perpustakaan Digital ITB

Artemisinin adalah suatu senyawa seskuiterpen lakton yang menjadi obat pilihan dalam mengobati penyakit malaria. Secara alami artemisinin dihasilkan dalam tanaman Artemisia annua dalam jumlah yang sedikit, akibatnya pasokan untuk memenuhi kebutuhan pasar tidak stabil dan harga obat menjadi tidak ekonomis. Produksi artemisinin yang rendah pada tumbuhan mendorong berbagai penelitian untuk memproduksi artemisinin secara rekayasa genetika, diantaranya melalui combinatorial biosynthesis untuk produksi prekursor artemisinin pada sel Escherichia coli. Di dalam tanaman artemisinin diproduksi melalui dua jalur biosintesis yaitu jalur mevalonat (MVA) dan metileritritol fosfat (MEP). Sel E. coli sendiri memiliki jalur MEP untuk memproduksi senyawa isopentenil pirofosfat (IPP) dan dimetilalil pirofosfat (DMAPP) yang merupakan prekursor paling awal untuk biosintesis artemisinin. Hal ini mendorong upaya untuk memproduksi prekursor artemisinin melalui ekspresi heterolog gen pengkode enzim yang terlibat pada biosintesis artemisinin pada E. coli. Adapun enzim yang terkait biosintesis artemisinin melalui jalur MEP diantaranya adalah deoksiselulosa fosfat sintase (DXS), isopentenil-pirofosfat delta isomerase (IDI), farnesil pirofosfat sintase (FPS), amorfadien sintase (ADS), sitokrom p450 monooksigenase (CYP), aldehid artemisinat delta-11(13) reduktase (DBR2) dan aldehid dehidrogenase (ALDH1). Untuk dapat mengekspresikan gen-gen tersebut pada sel E. coli dilakukan penyisipan coding sequence (CDS) masing-masing gen target ke dalam plasmid sebagai vektornya. Pada penelitian ini dipilih tiga plasmid yaitu pETDUET-1, pRSFDUET-1 dan pCDFDUET-1. CDS gen FPS, ADS dan CYP disisipkan pada plasmid pETDUET-1 menghasilkan plasmid rekombinan pETDfac, CDS gen DBR2 dan ALDH1 disisipkan pada plasmid pRSFDUET-1 menghasilkan plasmid rekombinan pRSFDda dan CDS gen DXS dan IDI disisipkan pada plasmid pCDFDUET-1 menghasilkan plasmid rekombinan pCDFDdi. Penyisipan CDS gen FPS, ADS dan CYP telah dilakukan pada penelitian sebelumnya dengan metode pemotongan dan ligasi, sedangkan penyisipan CDS gen DBR2, ALDH1, dxs dan idi dilakukan secara sintesis oleh perusahaan GenScript. Rancangan konstruksi gen dalam plasmid dilakukan secara komputasi dengan bantuan berbagai perangkat lunak diantaranya SnapGeneTM 1.1.3, Codon Usage AnalyzerBioinformatics.org, DNASTAR, JustBio, BLAST® dan Expasy. CDS seluruh gen diperoleh dari GenBank NCBI dengan kode akses masing-masing adalah NC_000964 (dxs), NC_000913 (idi), EU704257.1 (DBR2), FJ809784.1 (ALDH1), KJ609177.1 (FPS), DQ241826.1 (ADS) dan HQ315834.1 (CYP71AV1/CYP). Beberapa faktor menjadi pertimbangan saat melakukan konstruksi gen diantaranya pemilihan vektor untuk mencegah inkompatibilitas plasmid, pemilihan sisi pemotongan tempat penyisipan CDS dan ketepatan penempatan His-tag agar terdapat di ujung hidrofil serta tidak mengganggu sisi aktif protein. Konstruksi gen dilakukan sedemikian rupa untuk menghindari bias kodon dan non-inframe codon yang dapat menyebabkan kesalahan pada saat translasi. Plasmid rekombinan yang diperoleh selanjutnya dikarakterisasi dengan analisis migrasi, analisis pemotongan, polymerase chain reaction (PCR) dan sekuensing. Berdasarkan keseluruhan hasil analisis diketahui bahwa seluruh CDS gen terkait biosintesis artemisinin telah berhasil disisipkan dalam masing-masing plasmid. Plasmid rekombinan selanjutnya ditransformasikan ke dalam E. coli BL21(DE3) untuk ekspresi gen sisipan. Beberapa faktor terkait ekspresi gen sisipan telah dioptimasi seperti konsentrasi isopropil-?-D1-tiogalaktopiranosida (IPTG) sebagai penginduksi, waktu induksi, suhu induksi dan media kultur. Hasil ekspresi gen sisipan dianalisa dengan sodium dodesil sulfat-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) dan Western blot. Berdasarkan hasil SDS-PAGE diketahui bahwa kondisi optimum untuk produksi protein adalah induksi IPTG 0,5 mM dengan waktu induksi 24 jam pada 20 °C menggunakan media Luria Bertani. Dari hasil analisis Western blot terhadap total protein (whole cell protein), protein bentuk badan inklusi (inclusion bodies protein, IB) dan protein terlarut (soluble protein) diperoleh bahwa mayoritas protein dihasilkan dalam bentuk IB dan hanya protein IDI dan sejumlah kecil CYP dan DBR2 yang dihasilkan dalam bentuk terlarut. Analisis metabolit hasil kerja enzim di dalam sel dilakukan terhadap ekstrak metanol:air (7:3) sel E. coli BL21(DE3) rekombinan dengan metode LCMS/MS. Senyawa prekursor artemisinin yang diamati yaitu asam artemisinat, tidak ditemukan pada hasil analisis. Sementara itu, senyawa IPP yang merupakan prekursor paling awal untuk biosintesis artemisinin yang secara alami terdapat di sel E. coli juga tidak terdeteksi pada analisis dengan LCMS/MS. Hal ini diduga karena ketidaksesuaian sistem LCMS/MS yang digunakan, karena senyawa IPP murni yang digunakan sebagai standar juga tidak terdeteksi. Namun demikian, keberhasilan penyisipan tujuh gen terkait biosintesis artemisinin ini dapat menjadi landasan yang kuat dan memberikan harapan untuk menghasilkan senyawa prekursor artemisinin melalui optimasi kondisi ekspresi lebih lanjut sehingga diperoleh protein terlarut dan aktif secara biologis.