Perpustakaan Digital ITB

Tanaman Angelica keiskei (Miq.) Koidzumi (Ashitaba) telah dibudidayakan di Lombok (Pegunungan Rinjani) Indonesia, dan digunakan secara empirik sebagai diuretik, menurunkan tekanan darah, diabetes, dan mencegah obesitas. Daun dan batangnya merupakan bagian tanaman yang sering dikonsumsi oleh masyarakat. Ciri khas pada tanaman ini adalah getah kuning yang terdapat pada bagian batangnya. Pada getah kuning batang A. keiskei diketahui mengandung senyawa utama kalkon yaitu xantoangelol (XAG), dan 4-hidroksiderisin (4-HD). Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa XAG dan 4-HD dari ekstrak getah kuning batang A. keiskei, kemudian dilanjutkan dengan menelaah aktivitas inhibisi terhadap enzim 3-hidroksi-3-metilglutaril-koA (HMG-KoA) reduktase, ?-glukosidase, dan dipeptidil peptidase-IV (DPP-IV) secara in silico, serta menelaah aktivitas inhibisi pada enzim terpilih yaitu enzim ?- glukosidase, dan DPP-IV secara in vitro. Bagian yang digunakan pada tahap awal adalah daun, batang dan getah kuning batang A. keiskei. Kepada masing-masing simplisia daun dan batang sebanyak 100 dimaserasi selama 72 jam menggunakan etanol 96% (1 : 6,5), kemudian dipekatkan sehingga diperoleh rendemen berturut-turut sebesar 6,48 dan 6,53 % b/b. Sebanyak 750 mL getah kuning batang A. keiskei dikering-bekukan, dan diperoleh serbuk kuning-jingga sebanyak 31,59 g. Analisis kualitatif dilakukan pada ekstrak etanol daun, batang, dan getah kuning menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) F254 sehingga dapat diamati pola kromatogram senyawa utama tanaman A. keiskei. Hasil kromatogram KLT menunjukkan spot terbaik yang mengandung senyawa utama tanaman A. keiskei adalah ekstrak etanol getah kuning. Penelitian ini memberikan data awal bagian tanaman yang akan digunakan untuk proses isolasi senyawa utama. Proses isolasi dilakukan pada serbuk getah kuning batang A. keiskei. Serbuk getah kuning (10 g) dilarutkan dalam 50 mL etanol 96%, kemudian filtrat etanol getah batang ditambahkan air sebanyak 100 mL, lalu dilanjutkan dengan ekstraksi caircair tiga kali dengan menggunakan pelarut yang berbeda kepolarannya (1:1; v/v triplo) sehingga menghasilkan rendemen berturut-turut, yaitu, fraksi n-heksana (0,43 g), fraksi etil asetat (5,86 g), dan fraksi air (2,90 g). Pada fraksi etil asetat (2 g) dilakukan fraksinasi lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom gravitasi (2,0 x 45 cm) yang dikemas dengan 32,33 g Kieselgel 60, dan dielusi menggunakan fase gerak kombinasi n-heksana-aseton (100:0 ? 0:100 v/v) sehingga menghasilkan subfraksi F1-F6. Hasil analisis kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) menunjukkan senyawa utama terdapat pada subfraksi F3 dan F5. Pada subfraksi F3 (300 mg) dilakukan pemisahan lebih lanjut menggunakan kromatografi kolom gravitasi sehingga diperoleh isolat dari subfraksi sbf3C sebanyak 75,5 mg yang disebut sebagai isolat 1. Karakterisasi selanjutnya dari isolat 1 dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV, spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti (NMR). Hasil menunjukkan bahwa panjang gelombang serapan maksimum pada 364 nm, serta memiliki massa [M+H] + m/z = 339,22 dengan rumus molekul C21H22O4. Hasil analisis 13 C-RMI (125 MHz) dan 1 H-RMI (500 MHz), serta RMI dua dimensi (2D) dilakukan dengan koherensi kuantum tunggal heteronuklir ( 1 H, 13 C gHSQC), kemudian dikonfirmasi bahwa isolat 1 merupakan senyawa 4-hidroksiderisin (4-HD). Subfraksi F5 (770 mg) dipisahkan lebih lanjut dengan kromatografi kolom gravitasi sehingga diperoleh isolat pada subfraksi sbf5L sebanyak 194,2 mg yang disebut sebagai isolat 2. Isolat 2, merupakan kristal kuning yang memiliki titik leleh 114- 114,4 o C. Karakterisasi selanjutnya dari isolat 2 dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV, spektroskopi massa (TOF-MS-ES+), dan resonansi magnetik inti (RMI). Hasil menunjukkan bahwa panjang gelombang serapan maksimum pada 368 nm, serta memiliki massa [M+H] + m/z = 393,20 dengan rumus molekul C25H28O4. Hasil analisis 13 C-RMI (125 MHz) dan 1 H-RMI (500 MHz), serta RMI dua dimensi (2D) dilakukan dengan koherensi kuantum tunggal heteronuklir ( 1 H, 13 C gHSQC), kemudian dikonfirmasi bahwa isolat 2 merupakan senyawa xantoangelol (XAG). Tahapan penelitian selanjutnya dilakukan proses penambatan molekul pada enzim HMG-KoA reduktase, ?-glukosidase, dan DPP-IV secara in silico. Struktur kristal enzim yang digunakan adalah 1HW9, 3W37, 1X70 yang diperoleh dari Protein Data Bank (PDB). Program Open Babel, PLANTS1.2, shell script MGLTools1.5.6 digunakan untuk preparasi awal ligan dan reseptor. Program AutoDock Vina 1.1.2 digunakan untuk proses penambatan ulang. Program Pymol dan PoseView digunakan untuk perhitungan root mean square deviation (RSMD) dan visualisasi hasil penambatan ulang. Simvastatin, akarbosa, dan sitagliptin digunakan sebagai ligan pembanding. Penelitian ini memberikan data energi interaksi (Ei), tetapan inhibisi (Ki), dan mode ikatan antara ligan uji (isolat) dengan reseptor (enzim). Hasil studi in silico antara simvastatin dengan HMG-KoA reduktase menunjukkan adanya lima ikatan hidrogen dengan residu asam amino di kantung aktif enzim yaitu Arg590, Ser684, Lys691, Lys735, Asn755, dengan energi interaksi (Ei) -6.97 kkal/mol; konstanta inhibisi (Ki) 10,8 ?M. Senyawa 4-HD menunjukkan tiga ikatan hidrogen dengan Arg590, Ser684, dan Lys735. 4-HD juga membentuk interaksi hidrofobik dengan Lys692, Leu853, dan Ala856. Senyawa XAG berinteraksi dengan HMG-KoA reduktase melalui pembentukan empat ikatan hidrogen, yaitu dengan Lys691, Lys735, dan Asn755, selain itu juga diamati adanya jembatan garam dengan Arg590 dan Asp690, serta interaksi hidrofobik dengan Cys561, Lys735, Leu853. Berdasarkan hasil penambatan molekul kedua senyawa tersebut, baik XAG (Ei = - 7,31 kkal/mol; Ki = 4.65 ?M) maupun 4-HD (Ei = -6,7 kkal/mol; Ki = 13,3 ?M) dapat berinteraksi dengan beberapa residu asam amino penting pada cis-loop (kantung aktif) HMG-KoA reduktase, yang menyerupai interaksi simvastatin. Oleh karena itu dapat diprediksi bahwa kedua senyawa tersebut mungkin dapat menghambat HMG-KoA reduktase. XAG memiliki afinitas interaksi pada HMG- KoA reduktase lebih baik daripada 4-HD. Hasil studi in silico antara akarbosa dengan ?-glukosidase menunjukkan akarbosa berinteraksi membentuk tiga ikatan hidrogen dengan residu asam amino Asn237, Arg552, Asp558. Selain itu juga diamati adanya jembatan garam dengan Asp232, Asn237, Trp239, Asp469, Met470 (Ei = -7,81 kkal/mol; Ki = 2,14 ?M). Senyawa 4-HD berinteraksi dengan ?-glukosidase melalui pembentukan satu ikatan hidrogen dan jembatan garam dengan Asp232, serta 5 interaksi hidrofobik. Senyawa XAG dapat berinteraksi dengan ?-glukosidase melalui pembentukan ikatan hidrogen dengan Ala234 dan jembatan garam dengan Asp232, serta 9 interaksi hidrofobik. Berdasarkan hasil penambatan molekul kedua senyawa tersebut, baik XAG (Ei = - 7,81 kkal/mol; Ki = 1,99 ?M) maupun 4-HD (Ei= -7,4 kkal/mol; Ki 3,99 ?M) dapat berinteraksi dengan beberapa residu asam amino penting posisi 232-237 pada Nterminal pita N-loop (kantung aktif) ?-glukosidase, yang menyerupai interaksi akarbosa. Oleh karena itu dapat diprediksi bahwa kedua senyawa tersebut mungkin dapat menghambat ?-glukosidase. XAG memiliki afinitas interaksi pada ?- glukosidase lebih baik daripada 4-HD. Hasil studi in silico antara sitagliptin dengan DPP-IV menunjukkan interaksi dengan dua residu asam amino Glu205 dan Glu206 dengan membentuk jembatan garam, kemudian terdapat lima interaksi hidrogen dengan residu asam amino Ser209, Arg125, Arg358, Tyr662, dan Asn710, serta interaksi hidrofob (?–?) dengan Phe357 (Ei = -9,24 kkal/mol; Ki = 0,172 M). Senyawa 4-HD berinteraksi dengan DPP-IV melalui dua ikatan hidrogen dengan Glu206 dan Tyr662 pada gugus hidroksil 4-HD, dan interaksi ?-?dengan Phe357 pada cincin A. Senyawa XAG berinteraksi dengan DPP-IV melalui dua ikatan hidrogen dengan Glu205 dan Glu206, dan interaksi ?-?dengan Phe357 pada cincin B. Berdasarkan hasil penambatan molekul kedua senyawa tersebut, baik XAG (Ei = -8,34 kcal/mol; Ki= 0,873 ?M) maupun 4-HD (Ei = -7,42 kkal/mol; ki = 3,99 ?M) dapat berinteraksi dengan beberapa residu asam amino penting Glu205 dan Glu206 pada subsitus S2, serta terdapat interaksi dengan residu asam amino Phe357 pada subsitus S2 ekstensif di kantung aktif enzim DPP-IV, yang menyerupai interaksi sitagliptin. Oleh karena itu dapat diprediksi bahwa kedua senyawa tersebut mungkin dapat menghambat DPP-IV. XAG memiliki afinitas interaksi pada DPP-IV lebih baik daripada 4-HD. Tahapan akhir penelitian ini adalah menguji aktivitas penghambatan senyawa XAG dan 4-HD terhadap enzim ?-glukosidase dan DPP-IV secara in vitro menggunakan 96-microwell plate. Pengujian pertama dilakukan pada enzim ?-glukosidase. Aktivitas penghambatan terjadi karena adanya reaksi enzimatis antara enzim ?- glukosidase dengan p-nitrofenil-?-glukopiranosa (PNPG) sebagai substrat. Absorbansi p-nitrofenol yang dilepaskan dianalisis menggunakan Multiscan pada panjang gelombang 405 nm. Akarbosa digunakan sebagai kontrol positif. Hasil pengujian menunjukkan bahwa nilai IC50 senyawa XAG dan 4-HD berturut-turut adalah 14,45 µM dan 80,82 µM, penghambatan aktivitas kedua senyawa tersebut lebih baik dari akarbosa dengan nilai IC50 = 207 µM. Pengujian in vitro dilanjutkan pada enzim DPP-IV. Aktivitas penghambatan terjadi dengan reaksi enzimatis antara enzim DPP-IV dengan Gli-Pro-p-Nitroanilida Hidroklorida (GPPN) sehingga melepaskan p-nitroanilin (pNA), produk berwarna kuning. Absorbansi p-NA yang dilepaskan dianalisis menggunakan Multiscan pada panjang gelombang 405 nm. Sitagliptin digunakan sebagai kontrol positif. Hasil uji in vitro menunjukkan bahwa senyawa XAG dan 4-HD dapat menghambat enzim DPP-IV dengan nilai IC50 = 10,49 µM dan 13,95 µM. Namun, penghambatan aktivitas kedua senyawa tersebut lebih lemah dari sitagliptin dengan nilai IC50 = 0,87 µM. Kedua senyawa utama XAG dan 4-HD diprediksi memiliki peran dalam mekanisme antiDMT2 melalui penghambatan pada enzim ?-glukosidase dan DPP- IV terbukti secara in silico dan in vitro, serta dapat dijadikan sebagai senyawa identitas pada tanaman A. keiskei. Aktivitas penghambatan senyawa utama terhadap enzim ?-glukosidase lebih baik dari akarbosa. Ekstrak etanol daun dan batang A. keiskei dapat dikembangkan menjadi salah satu alternatif produk herbal dalam mengatasi DMT2. Penelitian ini dapat dilanjutkan dengan uji aktivitas antidiabetes secara in vivo pada hewan, uji toksisitas akut dan/atau subkronik, serta uji farmakokinetik pada hewan.