Perpustakaan Digital ITB

Mangan superoksida dismutase Staphylococcus equorum rekombinan (rMnSODSeq) dalam bentuk alaminya memiliki kestabilan yang baik terhadap rentang pH luas dan suhu tinggi. rMnSODSeq alami relatif tidak stabil pada pemaparan sinar UVC jangka panjang sehingga direkayasa menjadi beberapa mutan meliputi G125N, S126C, L169W dan G125T untuk memperbaiki kestabilannya. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh substitusi G125T, G125N, S126C dan L169W terhadap aktivitas dan kestabilan serta kondisi kristalisasinya. Skrining kondisi kristalisasi rMnSODSeq dilakukan sebagai langkah awal dalam penentuan struktur tiga dimensinya. Penelitian ini diawali dengan isolasi plasmid dan konfirmasi kebenaran mutan dengan analisis migrasi, pemotongan dan urutan nukleotida. Overproduksi protein dilakukan pada suhu 37°C selama 4 jam dengan induksi isopropil ?-D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG) 1 mM. Pemurnian protein dilakukan dengan kromatografi afinitas kolom Ni 2+ -NTA. Pengujian aktivitas protein dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif dengan metode zimografi dan kolorimetri. Stabilitas protein diuji terhadap pemaparan UVC dan variasi suhu. Skrining kristalisasi protein dilakukan menggunakan metode tetes gantung. Hasil menunjukkan terjadinya penurunan aktivitas spesifik G125N, S126C, L169W dan G125T berturut-turut adalah 989 U/mg, 571 U/mg, 450 U/mg dan 62 U/mg, namun memiliki stabilitas terhadap pemaparan UVC dan suhu jangka panjang lebih baik. Aktivitas residual rMnSODSeq G125N, S126C, L169W dan G125T setelah paparan suhu 90°C berturut-turut adalah 78,6%; 65,9%; 63,7% dan 62,1% sedangkan aktivitas residual setelah paparan UVC selama 60 menit adalah 79%; 78%; 76% dan 73% terhadap aktivitas awal masing-masing mutan. Kondisi kristalisasi rMnSODSeq G125T dan S126C yang baik diperoleh pada campuran larutan 20% PEG 600, dapar Tris-HCl 0,1 M pH 7,4. Komposisi larutan induk pada S126C meliputi kombinasi 10% PEG 600 dan 10% PEG 4000, dapar Tris-HCl 0,1 M pH 7,4 dan konsentrasi protein 8 mg/mL dengan volume tetesan 4 µL. Kondisi kristalisasi yang optimal pada mutan L169W belum dapat ditentukan. Substitusi G125T, S126C, L169W dan G125N pada rMnSODSeq mempengaruhi kondisi kristalisasi protein.