Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (E.C 3.2.1.1) mengkatalisis hidrolisis ikatan ?-1,4-glikosidik secara endo pada pati. ?-Amilase yang dihasilkan dari Bacillus aquimaris BaqA mempunyai kemampuan menghidrolisis pati mentah tanpa adanya starch binding domain (SBD), yang umumnya ditemukan pada enzim pendegradasi pati mentah. BaqA dapat digolongkan ke dalam sub-keluarga baru GH13 berdasarkan adanya dua residu triptofan berurutan yang terletak di posisi 201 dan 202 (W201 dan W202) yang berpotensi dalam pengikatan bulir pati mentah. Tujuan pertama dari penelitian ini adalah untuk mempelajari fungsi kedua residu triptofan W201 dan W202. Sedangkan tujuan kedua adalah mempelajari karateristik BaqA (wildtype). Plasmid rekombinan pET30aEZ-BaqA digunakan sebagai template untuk konstruksi mutan melalui teknik PCR SDM (mutasi terarah). Dua pasang primer dirancang untuk mengubah kodon TGG triptofan menjadi kodon GCG alanin. Adanya mutasi pada BaqA01 (pET30aEZ-BaqAW201A) dan BaqA02 (pET30aEZ-BaqAW201A-W202A) telah dikonfirmasi melalui analisis urutan nukleotida. BaqA diekspresikan sebagai protein terlarut dan protein agregat pada E. coli ArcticExpress (DE3) yang ditunjukkan pada pita di ukuran sekitar ~58 kDa berdasarkan analisis SDS-PAGE. Aktivitas spesifik BaqA adalah sebesar 147,6 U/mg, yang diukur melalui metode DNS, sedangkan aktivitas spesifik mutan BaqA01 dan BaqA02 adalah 88,7 U/mg and 40,5 U/mg. Kemampuan BaqA dalam mendegradasi berbagai pati mentah, yaitu beras, sagu, kentang, ganyong, dan gandum yang ditunjukkan dengan jumlah gula pereduksi yang dihasilkan masing-masing adalah sebesar 1105,2 ?mol/mg, 2431,2 ?mol/mg, 2269,4 ?mol/mg, 2246,1 ?mol/mg, dan 2827,5 ?mol/mg. BaqA01 dan BaqA02 memiliki aktivitas degradasi pati mentah yang lebih rendah terhadap pati mentah dibanding dengan BaqA wildtype. Jumlah gula pereduksi yang dihasilkan oleh BaqA01 pada beras, sagu, kentang, ganyong, dan gandum adalah sebesar 346,1 ?mol/mg, 417,3 ?mol/mg, 437,7 ?mol/mg, 484,9 ?mol/mg, dan 638,2 ?mol/mg. Sedangkan oleh BaqA02 adalah sebesar 579,5 ?mol/mg, 633,9 ?mol/mg, 714,9 ?mol/mg, 879,1 ?mol/mg, dan 1140,0 ?mol/mg. Kedua hasil menunjukkan bahwa W201 dan W202 berperan dalam pengikatan pati terlarut dan pati mentah. Percobaan pemurnian BaqA wildtype terlarut yang belum berhasil, sehingga pemurnian BaqA dilakukan dari protein agregat (inclusion body) dengan menggunakan kromatografi afinitas Ni-NTA dalam keadaan terdenaturasi. BaqA agregat dilarutkan dengan larutan 8 M urea, kemudian dilakukan refolding dengan konsentrasi urea yang berkurang secara bertahap. Hasil SDS-PAGE mengindikasi bahwa telah didapatkan BaqA murni yang ditunjukkan dengan adanya 1 pita di ukuran sekitar ~58 kDa. BaqA murni memiliki aktivitas optimum pada 1% pati terlarut di pH 7,0 dan suhu 40 ?C, dan konsentrasi garam NaCl 150 mM pada 1% pati terlarut. Hasil yang menarik adalah BaqA murni masih memiliki aktivitas relatif sebesar 69% pada 500 mM NaCl dan 59% pada konsentrasi garam 1000 mM NaCl, dan BaqA masih memiliki aktivitas relatif lebih dari 50% pada pH 4,0- 9,0. Berdasarkan hasil penelitian, maka BaqA berpotensi untuk dapat digunakan dalam proses industri pati dikarenakan kemampuannya untuk degradasi pati mentah pada konsentrasi garam yang tinggi dan rentang pH yang luas pada suhu yang rendah.