Perpustakaan Digital ITB

α-Amilase (E.C. 3.2.1.1) merupakan enzim yang dapat menghidrolisis ikatan α-D-(1,4)-glikosidik pada pati menghasilkan oligosakarida yang linear dan bercabang dan dekstrin. Enzim ini banyak digunakan pada berbagai industri, seperti tekstil, deterjen, kertas, makanan, farmasi, dan bioethanol. α-Amilase yang berasal dari Saccharomycopsis fibuligera R64 (SfamyR64) merupakan glikoprotein yang mengandung residu karbohidrat. SfamyR64 diperkirakan memiliki dua sisi ikatan N-linked glycosylation, yaitu residu asam amino Asparagin 133 (N133) dan Asparagin 204 (N204). Sisi N204 merupakan sisi lestari glikosilasi pada Sfamy (α-amilase dari S. fibuligera), SfamyKZ (α-amilase dari S. fibuligera KZ), dan SfamyR64. Glikosilasi dapat mempengaruhi aktivitas dan stabilitas dari suatu protein. Tujuan penelitian ini adalah menghasilkan mutan SfamyR64N204Q dan mempelajari peran glikosilasi terhadap aktivitas dan stabilitas SfamyR64 yang dihasilkan dalam Pichia pastoris. Mutan SfamyR64N204Q diperoleh dengan melakukan mutasi terarah menggunakan pPICZαA-SfamyR64 yang mengandung gen pengode SfamyR64 wild type sebagai templat dengan sepasang primer yang membawa perubahan nukleotida AAT-CAA. Mutasi pada pPICZαA-SfamyR64 telah dikonfirmasi melalui analisis urutan nukleotida. P. pastoris GS115 dan KM71 ditransformasi dengan pPICZαA-SfamyR64 dan pPICZαA-SfamyR64N204Q. Ekspresi SfamyR64 dan SfamyR64N204Q dikendalikan oleh promotor AOX1 yang memerlukan metanol sebagai penginduksi, dan protein disekresikan karena adanya sinyal peptida α-factor. Uji aktivitas dengan menggunakan metode DNS menunjukkan bahwa aktivitas spesifik SfamyR64 yang diekspresikan oleh P. pastoris GS115 dan KM71 masing-masing adalah 1135,6 U/mg dan 55665,7 U/mg, sedangkan mutan SfamyN204Q yang diekspresikan oleh P. pastoris GS115 dan KM71 memiliki aktivitas lebih rendah dengan nilai berturut-turut sebesar 241,1 U/mg dan 45463,9 U/mg. Hasil ini menunjukkan bahwa glikosilasi mempengaruhi aktivitas SfamyR64 dalam mendegradasi pati terlarut.