digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

Superoksida dismutase (SOD) terlibat dalam pertahanan sel terhadap radikal superoksida, dengan memfasilitasi konversi radikal superoksida menjadi oksigen dan hidrogen peroksida. Enzim ini berhasil diisolasi dari Staphylococcus equorum. SOD S. equorum berhasil dioverekspresikan di Escherichia coli BL21(DE3)(rMnSODSeq), dan ditemukan berbentuk dimer serta membutuhkan kofaktor ion logam mangan untuk aktivitasnya. Struktur dimer berkontribusi dalam kestabilan dan aktivitas SOD. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan kestabilan dimer rMnSODSeq alami dengan substitusi asam amino di daerah yang melindungi pusat aktif dan di daerah antar muka dimer. Penelitian dimulai dengan menentukan situs substitusi asam amino menggunakan perangkat lunak COOT secara in silico. Situs substitusi yang dihasilkan adalah leusin169 menjadi tirosin (L169Y) dan glisin 125 menjadi asparagin (G125N). Substitusi L169Y dan G125N dilakukan pada tingkat DNA dengan mutagenesis situs terarah pada DNA pengkode rMnSODSeq pada pJexpress414_sodA. Hasil mutasi dikonfirmasi menggunakan analisis urutan nukelotida dan menunjukkan substitusi asam amino leusin169 menjadi tirosin dan glisin 125 menjadi asparagin berhasil dilakukan. Overproduksi rMnSODSeq alami dan mutan dilakukan pada suhu 25 °C 100 rpm dengan induksi isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) konsentrasi akhir 1 mM selama 5 jam. Overproduksi menghasilkan bobot pelet sel untuk rMnSODSeq alami dan mutan sebanyak 1,2 gram dan 1,3 gram per 250 mL media LB cair. Pemurnian rMnSODSeq alami dan mutan dilakukan menggunakan kromatografi kolom afinitas Ni2+-NTA dan kromatografi penukar anion Q-Sepharose. Hasil yang diperoleh berupa protein murni yang dikonfirmasi dengan keberadaan pita tunggal pada gel SDS-PAGE. Aktivitas rMnSODSeq alami dan mutandiuji secara kualitatif dan kuantitatif dengan zimografi dan kolorimetri. Persentase inhibisi rMnSODSeq alami dan mutan berturut-turut diketahui memiliki nilai 17,06 %, 15,66 % dan 15,54 %. Hasil uji thermal shift assay (TSA) menunjukkan bahwa rMnSODSeq alami memiliki Tm 54 °C dan 68 °C seperti yang dilaporkan sebelumnya, sedangkan rMnSODSeq L169Y dan G125N menunjukkan Tm 58 °C dan 54 °C. Substitusi asam amino L169Y dan G125N ditemukan tidak mempengaruhi aktivitas enzimatik namun mengubah pola kestabilan struktur dimer jika dibandingkan dengan rMnSODSeq alami