Perpustakaan Digital ITB

Mangan Superoksida Dismutase S. equorum rekombinan (rMnSODSeq) telah direkayasa dalam upaya peningkatan kestabilannya dengan mensubstitusi asam amino asparagin pada posisi ke 73 menjadi fenilalanin (N73F) dan serin pada posisi ke 126 menjadi sistein (S126C). Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan aktivitas rMnSODSeq rekombinan N73F dan S126C dengan alaminya dan kaitannya dengan struktur. Penelitian dimulai dengan isolasi dan konfirmasi kebenaran DNA pengkode rMnSODSeq pada pJexpress414-sod. Konfirmasi kebenaran tersebut menggunakan analisis urutan nukelotida dan menunjukkan substitusi nukleotida pengkode N73F dan S126C. Enzim-enzim tersebut berhasil dioverproduksi di Escherichia coli BL21(DE3), diisolasi, dan dimurnikan. Overproduksi rMnSODSeq alami dan mutan dilakukan pada suhu 37 ºC 150 rpm dengan induksi isopropyl ?-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) konsentrasi akhir 1 mM selama 4 jam. Pemurnian rMnSODSeq alami dan mutan dilakukan menggunakan kromatografi kolom afinitas Ni 2+ -NTA. Hasil yang diperoleh berupa protein murni yang ditunjukkan dengan keberadaan pita tunggal pada gel SDS- PAGE. Aktivitas rMnSODSeq alami dan mutan diuji secara kualitatif dan kuantitatif dengan zimografi dan kolorimetri. Uji aktivitas menunjukkan substitusi N73F dan S126C menurunkan aktivitas enzim. Aktivitas spesifik dari protein rMnSODSeq alami, N73F, dan S126C secara berturut-turut adalah 1958 Umg -1 , 417 Umg -1 , 666 Umg -1 . Namun demikian, ketahanan protein mutan terhadap paparan ke UVC relatif lebih tinggi dibanding protein alami. Aktivitas residual dari rMnSODSeq, N73F dan S126C setelah 45 menit pemaparan UVC adalah 71,3%, 97%, 103,3%. rMnSODSeq, N73F dan S126C stabil terhadap panas hingga suhu 80ºC dan dengan keberadaan zat pendenaturasi urea namun tidak pada guanidin HCl.