Perpustakaan Digital ITB

Mangan superoksida dismutase Staphylococcus equorum rekombinan (rMnSODSeq) merupakan enzim yang berperan melindungi sel dari efek keberadaan spesi oksigen reaktif. Protein rMnSODSeq memiliki stabilitas termal dan pH yang cukup baik namun peningkatan stabilitas masih terus dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan kestabilan termal monomer dengan penambahan ikatan disulfida intramolekular, tanpa mempengaruhi aktivitas protein. Pada penelitian ini rMnSODSeq dimodifikasi melalui introduksi penambahan ikatan disulfida intramolekular. Treonin-89, asparagin-187, valin-132, dan lisin-154 menjadi kandidat yang akan disubstitusi menjadi sistein secara independen. Substitusi dilakukan melalui mutagenesis situs terarah dengan suhu penempelan primer mutagenik masing-masing pada 55 dan 58?. Produk mutasi yang terkonfirmasi diintroduksikan ke dalam Escherichia coli BL21 (DE3) untuk overproduksi protein yang dilanjutkan pemurnian, karakterisasi, dan kristalisasi. Uji zimografi menunjukkan adanya penurunan aktivitas rMnSODSeq T89CN187C. Uji kolorimetri menunjukkan aktivitas rMnSODSeq T89C-N187C lebih rendah 41,8% dibandingkan rMnSODSeq, dengan aktivitas residual 78,5% pada 75?. Uji stabilitas struktur rMnSODSeq T89C-N187C dengan thermal shift assay menunjukkan peningkatan suhu leleh monomer dari 62 menjadi 66? pada kondisi tanpa aditif, dan dari 61 menjadi 63? pada perlakuan dengan ?- merkaptoetanol. Substitusi T89C-N187C mempengaruhi kondisi kristalisasi yang berbeda dari kondisi kristalisasi rMnSODSeq alami. Sementara itu, protein kasar rMnSODSeq V132C-K154C secara kualitatif memiliki aktivitas yang sangat rendah, sulit diekspresikan di sel E. coli BL21 (DE3) dan sulit dimurnikan dari pengotornya.