Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase merupakan enzim yang berperan sebagai katalis dalam reaksi hidrolisis pati dan secara luas banyak digunakan pada berbagai industri, seperti industri makanan, tekstil dan kesehatan. Gen pengkode ?-amilase (bmaN3) dari Bacillus megaterium NL3 yang diperoleh dari Danau Kakaban, Kalimantan Timur telah diisolasi dan dikarakterisasi. Analisis urutan nukleotida menunjukkan bahwa bmaN3 termasuk ke dalam Glycoside Hydrolase (GH) family 13 dan memiliki kesamaan 98% dengan ?-amilase B. megaterium DSM319 dan ?-amilase B. megaterium QM B1551. Selain itu, bmaN3 mengkode 484 residu asam amino dan tidak memiliki signal sequence yang mengindikasikan lokasi intraseluler. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengkloning dan mengekspresikan bmaN3 pada ragi Hansenula polymorpha. Fragmen gen bmaN3 diamplifikasi dengan menggunakan primer yang dirancang berdasarkan urutan bmaN3 yang telah dipublikasi (No akses.530746390) dan plasmid pGEM-bmaN3F sebagai cetakan. Primer memiliki sisi restriksi SalI dan HindIII yang diperlukan untuk subkloning fragmen gen bmaN3 ke dalam vektor ekspresi. Fragmen PCR dengan ukuran 1,5 kb, diligasi dengan vektor pGEM-T menghasilkan plasmid rekombinan pGEM-bmaN3. Selanjutnya, fragmen DNA bmaN3 yang dihasilkan dari pemotongan ganda SalI dan HindIII pada pGEM-bmaN3 disubkloning ke vektor ekspresi H. polymorpha pHIPX-4 yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama.. Plasmid rekombinan pHIPX4-bmaN3 yang dihasilkan diintregasikan ke dalam kromosom H. polymorpha NCYC495. Integrasi plasmid dalam kromosom pada transforman H. polymorpha NCYC495 diverifikasi menggunakan metoda PCR koloni. Keberadaan fragmen PCR berukuran 1,5 kb menunjukkan bahwa bmaN3 telah berhasil diintegrasikan. Ekspresi bmaN3 dibawah kontrol promotor MOX dan terminator MOX dan protein BmaN3 terdapat di dalam peroksisom ragi. Produksi BmaN3 dilakukan dalam medium mineral yang mengandung metanol 0,5% sebagai penginduksi pada suhu 37oC selama 120 jam. Ekstrak kasar protein dari transforman H. polymorpha NCYC495 menunjukkan aktivitas ?-amilase sekitar 64,7 U/mg berdasarkan metoda asam dinitrosalisilat. Untuk ke depannya, karakterisasi lebih lanjut akan dilakukan untuk memahami fungsi sel serta potensi aplikasi dari BmaN3.