Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (EC 3.2.1.1) mengkatalisis reaksi hidrolisis ikatan ?-1,4-glikosidik pada pati dan telah banyak diaplikasikan pada berbagai industri seperti industri makanan, minuman, tekstil dan farmasi. Perubahan pati menjadi oligosakarida secara konvensional menggunakan amilase termostabil pada tahap gelatinisasi dilakukan pada suhu tinggi. Penggunaan ?-amilase pendegradasi pati mentah pada suhu di bawah suhu gelatinisasi akan menghemat waktu dan mengurangi biaya produksi. Penelitian ?-amilase yang dapat mendegradasi pati mentah telah banyak dilakukan, namun eksplorasi terhadap mikroorganisme laut yang memiliki aktivitas ?-amilase tersebut masih terbatas. Pada penelitian sebelumnya, Bacillus megaterium NL3 penghasil amilase telah diisolasi dari danau Kakaban, Kalimantan Timur dan gen pengode ?-amilase bmaN2 telah diperoleh. Tujuan penelitian ini adalah mengamplifikasi gen pengode ?-amilase bmaN2, mengkloning open reading frame (ORF) bmaN2 ke vektor kloning pGEM-T dan vektor ekspresi pET30a serta mengekspresikannya Escherichia coli ArticExpress (DE3) dan mengkarakterisasi sifat biokimianya. Open reading frame (ORF) gen pengode bmaN2 diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan sepasang primer. Fragmen DNA ~1,5 kb bmaN2 telah berhasil diamplifikasi dan dimurnikan. Fragmen DNA bmaN2 disisipkan ke dalam vektor kloning pGEM-T, dan ditransformasikan ke sel inang E. coli TOP10F’. Transforman yang tumbuh diseleksi berdasarkan resistensi ampisilin dan aktivitas galaktosidase. Konfirmasi terhadap transforman yang diperoleh dilakukan dengan menggunakan size screening, PCR koloni dan analisis restriksi. Hasil analisis tersebut diperoleh dua koloni transforman yang positif membawa plasmid rekombinan yaitu pGEM_bmaN2_A21 dan pGEM_bmaN2_B3. Plasmid rekombinan yang dihasilkan kemudian dipotong dengan menggunakan BamHI dan EagI untuk diligasikan ke vektor ekspresi pET30a(+) yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Fragmen bmaN2/BamHI-EagI yang diperoleh ditransformasikan ke sel inang E. coli TOP10F’. Transforman diseleksi dengan ditumbuhkan pada medium selektif dan dianalisis kemudian dengan size screening, PCR koloni dan analisis restriksi. Beberapa hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa plasmid rekombinan pET_bmaN2 telah diperoleh. pET_bmaN2 digunakan sebagai templat untuk menentukan urutan nukleotida dari bmaN2. Open reading frame dari BmaN2 terdiri atas 1635 nukleotida yang mengode 545 asam amino, termasuk mature protein dan (His)6 pada N terminal. Berdasarkan hasil deduksi asam aminonya, BmaN2 tergolong pada keluarga amilase GH13 sub keluarga 36 dan memiliki tiga residu katalitik yang berperan dalam reaksi hidrolisisnya. ?-Amilase BmaN2 B. megaterium NL3 memiliki kemiripan sebesar 98% dengan amilase dari B. megaterium NCIB dengan substitusi 8 asam amino. BmaN2 diekspresikan pada E. coli ArticExpress (DE3) diinduksi dengan penambahan IPTG 0,5 mM. Hasil analisis SDS PAGE menunjukkan bahwa BmaN2 memiliki berat molekul ~61,5 kDa. Karakterisasi BmaN2 rekombinan dilakukan dengan menentukan aktivitasnya terhadap berbagai substrat menggunakan metode DNS. Aktivitas spesifik ekstrak kasar BmaN2 rekombinan terhadap pati terlarut, amilopektin, pullulan dan ?-siklodekstrin adalah 0,79 U/mg, 0,90 U/mg, 0,12 U/mg dan 0,04 U/mg. Satu unit menyatakan jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 ?mol produk (gula pereduksi) per menit. Derajat hidrolisis BmaN2 rekombinan terhadap sagu, beras, ganyong, singkong, dan jagung pada suhu 37 oC adalah sebesar 2,074%, 0,854%, 0,499%, 0,316% dan 4,405%, berturut-turut.