Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase (EC 3.2.1.1) merupakan endoenzim yang menghidrolisis ikatan ?-1,4- glikosidik pada oligosakarida dan polisakarida. ?-Amilase dihasilkan dari berbagai jenis organisme, seperti bakteri, ragi, jamur, dan tanaman. Pati adalah polisakarida yang terdiri dari amilosa dan amilopektin. Amilosa merupakan polimer tidak bercabang yang memiliki ikatan ?-1,4 glikosidik dan terdiri dari lebih 250 unit glukosa, sedangkan amilopektin adalah polimer yang disusun oleh unit glukosa bercabang dengan ikatan ?-1,4 glikosidik yang merupakan rantai utama dan ikatan percabangan pada ?-1,6 glikosidik. Pati berasal dari berbagai sumber, seperti jagung, singkong, ganyong, sagu, dan beras, memiliki perbedaan pada ukuran granula, struktur kristal, keberadaan pori, rasio kadar amilosa dan amilopektin, dan karakter lainnya, sehingga setiap jenis pati memiliki derajat hidrolisis yang berbeda. Mikroorganisme laut Bacillus megaterium NL3 menghasilkan setidaknya tiga jenis ?-amilase yang dinamakan BmaN1, BmaN2, dan BmaN3. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memurnikan dan mengkarakterisasi BmaN2 yang diekspresikan pada Escherichia coli. BmaN2 tergolong dalam keluarga glikosil hidrolase GH13, sub keluarga 36, memiliki tiga residu katalitik (Glu297, Asp257, dan Asp364), dan tidak memiliki domain pengikat pati. Gen pengkode ?-amilase BmaN2 diklon dalam pET30-BmaN2 dan diekspresikan pada Escherichia coli ArticExpress (DE3) dengan isopropyl-?-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sebagai penginduksi. BmaN2 dihasilkan sebagai protein intraseluler terlarut dengan berat molekul ~61,5 kDa berdasarkan hasil analisis menggunakan sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Aktivitas spesifik ekstrak kasar protein adalah 0,67 U/mg yang ditentukan dengan metode 3,5-dinitrosalicyclic acid (DNS). Satu unit didefinisikan sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 ?mol gula pereduksi per menit pada kondisi percobaan. BmaN2 yang dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA menghasilkan faktor kemurnian 32 kali lipat dengan aktivitas spesifik 21,7 U/mg dan yield 11 %. BmaN2 memiliki pH dan suhu optimum masing-masing adalah 8,0 dan 40 ? dan tetap stabil sampai NaCl 500 mM. Aktivitas spesifik BmaN2 terhadap pati terlarut, amilopektin, dan pululan masing-masing adalah 12,3 U/mg, 7,32 U/mg, dan 0,247 U/mg. Meskipun tidak memiliki domain pengikat pati, BmaN2 juga memiliki kemampuan untuk menghidrolisis granula pati mentah, seperti sagu, beras, ganyong, singkong, dan jagung dengan total gula pereduksi per mg pati adalah 3,07 mmol, 11,4 mmol, 11,4 mmol, 4,72 mmol, dan 8,04 mmol. Berdasarkan hasil yang telah diperoleh, maka BmaN2 memiliki potensi untuk digunakan dalam mengkonversi berbagai jenis pati mentah menjadi oligosakarida dengan nilai ekonomi yang lebih tinggi.