Perpustakaan Digital ITB

Bioetanol merupakan sumber energi terbarukan yang penting karena dapat digunakan untuk menggantikan bahan bakar fosil. Bioetanol memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah reduksi polusi, sumber energi terbarukan, dan material awal yang mudah untuk produksi. Produksi bioetanol generasi pertama menggunakan hasil pertanian mengundang konotasi negatif dalam isu “Food vs Fuel.” Produksi bioetanol generasi kedua digunakan untuk menghindari kontroversi ini dengan menggunakan material lignoselulosa. Material lignoselulosa ini mengandung sekitar 40% gula heksosa (D-glukosa) dan 20% gula pentose (D-xylosa). Ragi Saccharomyces cerevisiae yang digunakan untuk produksi bioetanol tidak dapat secara natural menggunakan D-xylosa sebagai sumber karbon. Masalah ini diatasi dengan menambahkan xylosa isomerase dari fungi dan overekspresi dari gen yang terlibat dalam jalur pentosa fosfat. Modifikasi ini membuat ragi dapat mengkonsumsi D-xylosa akan tetapi setelah D-glukosa dikonsumsi terlebih dahulu. Untuk meningkatkan kemampuan konsumsi bersama Dglukosa dan D-xylosa, rekayasa evolusi dari S. cerevisiae dilakukan dan galur baru, Evo6, diperoleh. Evo6 menunjukkan konsumsi D-xylosa yang lebih tinggi dibandingkan dengan galur awal, akan tetapi diikuti dengan penurunan konsumsi D-glukosa dan berakibat pada penurunan laju pertumbuhan. Tujuan utama dari penelitian ini adalah meningkatkan konsumsi D-glukosa pada Evo6 untuk produksi bioetanol yang lebih baik. Evo6 merupakan galur yang mudah mengalami flokulasi karena upregulasi yang signifikan dari Flo1, gen yang terlibat dalam flokulasi. Setelah delesi gen FLO1, Evo6 tidak mengalami flokulasi. Evo6ΔFlo1 yang digunakan pada penelitian ini menunjukkan konsumsi gula yang lebih baik dibandingkan dengan Evo6. Lebih lanjut, data RNAseq menunjukkan bahwa terjadi upregulasi Tsl1 dan Tps3 pada Evo6. Kedua gen ini adalah gen yang terlibat dalam pembentukkan trehalosa. Salah satu senyawa antara dalam jalur ini adalah trehalosa-6-fosfat yang merupakan inhibitor terhadap hexokinase yang melakukan fosforilasi glukosa menjadi glukosa-6-fosfat. Akumulasi dari trehalosa-6-fosfat ini menjelaskan penurunan konsumsi Dglukosa oleh galur Evo6ΔFlo1. Setelah delesi TPS3 atau TSL1 menggunakan sistem CRISPRCas9, diamati peningkatan konsumsi D-glukosa dan produksi etanol. Penelitian lebih lanjut menunjukkan terjadi penurunan level ekspresi Hxt1 secara signifikan pada Evo6 dibandingkan pada galur awal. Hxt1 merupakan transporter D-glukosa dengan affinitas rendah yang akan diekspresikan pada konsentrasi D-glukosa yang tinggi. Overekspresi dari Hxt1 pada Evo6 meningkatkan metabolisme D-glukosa tetapi diikuti dengan penurunan konsumsi Dxylosa. Level overekspresi dari Hxt1 dikonfirmasi dengan menggunakan qPCR untuk membandingkan pada level ekspresi aktin. Overekspresi dari Hxt1 dilakukan dengan mengubah promoter Hxt1 menggunakan sistem CRISPR-Cas9. Untuk elusidasi lebih lanjut dari peningkatan konsumsi D-xylosa pada Evo6, transporter Hxt37 yang mengandung mutasi titik N367I, yang ditemukan pada Evo6, dioverekspresi pada galur awal. Mutasi ini mengubah Hxt37 dari transporter yang spesifik untuk D-glukosa menjadi transporter yang spesifik untuk D-xylosa. Overekspresi dari Hxt37 dengan mutase titik N367I menghasilkan penurunan metabolisme Dglukosa secara signifikan namun hanya diikuti dengan peningkatan konsumsi D-xylosa yang tidak signifikan. Overekspresi dari Hxt37 dilakukan dengan menggunakan sistem plasmid. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa pada galur yang melakukan konsumsi bersama D-glukosa dan D-xylosa, metabolisme D-xylosa berujung pada peningkatan produksi trehalosa- 6-fosfat yang akan membatasi konsumsi D-glukosa.