Perpustakaan Digital ITB

Sistem seleksi berbasis Toksin/Antitoksin (TA) digunakan untuk menggantikan sistem seleksi antibiotik pada plasmid untuk produksi protein terapeutik rekombinan. Hal ini untuk mencegah penyebaran resistensi antibiotik dan hipersensitivitas pasien, terutama untuk antibiotik golongan beta laktam. Sistem TA yang telah dikembangkan di Laboratorium Bioteknologi Farmasi ITB adalah sistem TA yang terbagi ke dalam dua plasmid yakni plasmid pDCSA yang membawa gen pengkode CcdA dan pDCSB yang membawa gen pengkode toksin CcdB. Antitoksin CcdA terekspresi secara konstitutif, sedangkan toksin CcdB diinduksi dengan L-arabinosa. pDCSB dikonstruksi dari plasmid pUC-Kan_ccdB yang memiliki dua ori yakni turunan pMB1 (500-700 salinan/sel) dan p15A (~15 salinan/sel), sedangkan pDCSB hanya memiliki ori p15A. Data pertumbuhan Escherichia coli BL21(DE3) yang membawa plasmid pDCSA/pDCSB dengan adanya L- arabinosa 2% memiliki kurva pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan E. coli yang membawa pDCSA/pUC-Kan_ccdB. Hal tersebut diduga karena jumlah salinan pDCSB lebih rendah dibandingkan pUC-Kan_ccdB. Untuk mengetahui perbandingan jumlah salinan plasmid tersebut di dalam sel, maka dilakukan analisis perbandingan jumlah salinan plasmid dengan metode quantitative polymerase chain reaction (qPCR). qPCR yang dilakukan menggunakan 2 pasang primer yang baru dirancang untuk menarget gen ccdB pada plasmid. Primer yang menarget kromosom adalah primer tdk yang telah digunakan dalam penelitian sebelumnya untuk normalisasi hasil. Primer yang menarget gen ccdB pada kedua plasmid, yakni qPN dan qP12 dirancang dan kualitasnya dianalisis secara in silico, dilanjutkan dengan analisis in-vitro untuk spesifisitas primer, optimasi kondisi PCR, dan penetapan efisiensi primer. Penetapan perbandingan jumlah salinan plasmid menggunakan sampel lisat sel E. coli yang membawa masing masing plasmid. Kedua primer yang telah dirancang terbukti dapat mengamplifikasi plasmid murni dengan efisiensi terkategori baik sebesar 1,93 untuk primer qP12 dan 1,92 untuk primer qPN dengan Tm produk masing masing 84,5 °C dan 83,55 °C. Kurva disosiasi pada percobaan qPCR menggunakan sampel lisat sel dengan primer qP12 menunjukkan beberapa puncak yang menandakan bahwa primer qP12 tidak spesifik untuk sampel tersebut. Untuk selanjutnya, penentuan perbandingan jumlah salinan plasmid di dalam sel hanya menggunakan primer qPN dan tdk. Hasil analisis qPCR menunjukkan jumlah salinan plasmid pUC-Kan_ccdB 10,8 ± 0,73 kali lebih banyak dari pDCSB. Hal tersebut mengindikasikan keberadaan dua ori pada pUC-Kan_ccdB menginterferensi salinan plasmid di dalam sel.