Perpustakaan Digital ITB

Diabetes nefropati (DN) adalah komplikasi utama dari diabetes melitus yang dapat menyebabkan kerusakan ginjal. Transforming Growth Factor-Beta 1 (TGF-?1) merupakan mediator utama dalam patogenesis DN. Terapi yang efektif untuk DN belum tersedia hingga saat ini. Salah satu pendekatan yang potensial dikembangkan adalah terapi genetik CRISPR-Cas9 untuk meredam ekspresi gen TGF-?1. Penelitian sebelumnya telah mengembangkan CRISPR-Cas9 dalam bentuk ribonukleoprotein (RNP) dengan sistem penghantaran nanostructured lipid carrier (NLC) yang dapat menurunkan ekspresi mRNA gen TGF-?1 hingga 67% pada sel HEK293T secara in vitro. Namun, aplikasi sistem ini dalam pengujian in vivo menghadapi kendala seperti kebutuhan protein Cas9 fungsional dan sgRNA murni dalam jumlah besar. Strategi lain yang dapat digunakan adalah sistem CRISPR-Cas9 berbasis plasmid rekombinan sehingga memungkinkan produksi skala besar secara lebih efisien. Selain itu, sistem penghantaran NLC yang ada saat ini memiliki keterbatasan loading capacity yang rendah serta profil sirkulasi dan distribusi pada ginjal yang belum optimal. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengembangkan sistem penghantaran baru berupa liposom kationik yang mampu menghantarkan plasmid CRISPR-Cas9 melewati hambatan ekstraseluler dan intraseluler ke nukleus sel, serta mengevaluasi efektivitas peredaman gen TGF-?1 secara in vitro. Liposom kationik diformulasikan dengan metode hidrasi lapis lipis dengan komponen yang terdiri dari 1,2 dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC), 1,2 dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP), kolesterol, natrium oleat (NaOl), dan 1,2 dioleoyl sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polyethyleneglycol)-2000] ammonium salt (DSPE-PEG2000). Evaluasi sirkulasi sistemik liposom dan biodistribusi in vivo dilakukan pada mencit model DN yang diinduksi streptozotocin (STZ) (40 mg/kg BB) menggunakan liposom berlabel fluoresen DiD dengan variasi modifikasi PEG. Profil sirkulasi sistemik liposom dievaluasi dari sampel darah pada rentang interval 5 menit hingga 48 jam pascainjeksi menggunakan Glomax microplate reader, dilanjutkan pengujian biodistribusi organ secara ex vivo menggunakan In vivo Imaging System (IVIS). Evaluasi in vitro pada sel SV40-MES13 mencakup elusidasi mekanisme cellular uptake liposom berlabel DiD dengan menggunakan inhibitor jalur endositosis spesifik (sukrosa, filipin III, amilorida) dan analisis ekspresi mCherry yang diamati dengan menggunakan Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). Aktivitas peredaman gen dievaluasi dengan menggunakan qRT-PCR. Hasil pengujian in vivo menunjukkan profil sirkulasi dalam darah dan akumulasi ginjal paling optimal dicapai oleh liposom dengan modifikasi PEG 15% sehingga dipilih untuk pengujian tahap selanjutnya. Pada pengujian cellular uptake secara in vitro, penambahan filipin III secara signifikan menurunkan pendaran DiD. Hasil ini mengonfirmasi bahwa cellular uptake didominasi oleh jalur endositosis yang dimediasi kaveola sebesar 81,3%. Jalur endositosis melalui kaveola secara efektif mengarahkan transportasi intraseluler plasmid menuju retikulum endoplasma (ER) sebagai rute alternatif untuk mencapai nukleus sehingga plasmid dapat terhindar dari degradasi lisosom. Adanya ekspresi mCherry pada mikroskop confocal menunjukkan kemampuan penghantaran plasmid ke nukleus serta berjalannya sistem ekspresi plasmid tersebut. Uji aktivitas menunjukkan respons pengeditan gen paling optimal pada 72 jam pascatransfeksi, yang secara signifikan menurunkan ekspresi mRNA TGF-?1 hingga 59% (p < 0,0001), dibandingkan dengan penurunan sebesar 39% (p < 0,05) pada inkubasi 48 jam pada sel SV40-MES13. Berdasarkan hasil tersebut, liposom yang dikembangkan terbukti mampu memfasilitasi penghantaran plasmid CRISPR-Cas9 dalam melewati hambatan ekstraseluler dan intraseluler menuju nukleus sel target secara in vitro dan in vivo. Selain itu, formula liposom-plasmid CRISPR-Cas9 mampu memberikan respons peredamanan gen yang tinggi sehingga sistem ini sangat potensial untuk dieksplorasi lebih lanjut pada tahapan studi efikasi secara in vivo.