Perpustakaan Digital ITB

Pemurnian protein merupakan tahap pen4ng dalam bioteknologi, dengan teknik kromatografi yang umum digunakan untuk memisahkan protein target dari residu seluler. Immobilised Metal A?nity Chromatography (IMAC) dengan penggunaan tag polihis4din (His-tag) sering dimanfaatkan pada tahap awal penangkapan protein. His-tag umumnya ditempatkan pada ujung N-terminal atau C-terminal, bergantung pada orientasi yang memas4kan paparan permukaan yang cukup untuk berikatan dengan resin Ni-NTA tanpa mengganggu ak4vitas enzim. Peneli4an ini berfokus pada enzim katalase HPII seq dan kera4nase, yang sebelumnya 4dak dapat mengikat resin secara efisien menggunakan kromatografi Ni-NTA ke4ka diekspresikan dengan His-tag pada N-terminal. Tujuan peneli4an ini adalah mengembangkan sistem ekspresi E. coli untuk kedua enzim tersebut dengan memindahkan His-tag ke C-terminal, sehingga meningkatkan efisiensi pengikatan tanpa menurunkan fungsi enzima4k. Gen target dikloning ke dalam backbone plasmid pET16b_rec menggunakan metode QuickStep Cloning, yaitu teknik PCR tanpa restriksi yang memanfaatkan megaprimer. Op4masi PCR dicapai pada suhu annealing 60°C dengan rasio primer (cterm:mega) 2:1 untuk katalase dan 10:1 untuk kera4nase. Keberhasilan pemindahan 8x His-tag ke C-terminal dikonfirmasi melalui analisis migrasi gel, pemetaan restriksi, dan sekuensing DNA. Setelah diekspresikan pada E. coli BL21(DE3), protein rekombinan— katalase HPII seq berukuran 77 kDa dan kera4nase matur berukuran 29 kDa—berhasil tertahan pada resin Ni-NTA. Uji ak4vitas kualita4f menunjukkan bahwa kedua enzim tetap mempertahankan fungsi biologisnya: katalase menunjukkan ak4vitas katali4k, sedangkan kera4nase menunjukkan ak4vitas kaseinoli4k dan kera4noli4k. Temuan ini menunjukkan bahwa penambahan His-tag pada C-terminal mampu mengatasi keterbatasan pengikatan yang muncul pada His-tag N-terminal, tanpa mengganggu integritas struktural maupun ak4vitas enzima4k.