Perpustakaan Digital ITB

Keratin merupakan protein struktural yang tidak larut, terdapat pada kulit, rambut, bulu, kuku, dan tanduk. Salah satu enzim yang mampu mendegradasi keratin adalah keratinase, yaitu enzim ekstrasel yang dihasilkan oleh organisme prokariot dan eukariot, sebagian besar diisolasi dari lingkungan kaya keratin. Keratinase memiliki potensi pemanfaatan di bidang kosmetika, antara lain untuk pengobatan jerawat, eksfoliasi kulit, perawatan kutikula, kuku yang menebal, dan perawatan rambut. Di bidang farmasi, keratinase dimanfaatkan untuk pengobatan hiperkeratosis seperti psoriasis dan infeksi dermatofit seperti onkomikosis dan calluses. Penelitian sebelumnya bersama mitra Program Penelitian Kolaborasi Indonesia (2020-2021) berhasil mengisolasi bakteri simbion (Bacillus velezensis EC36) dari spons air tawar Eunapius carteri. Dari genom simbion tersebut, gen pengkode gen serin protease berhasil dikloning ke plasmid pET16b di Laboratorium Bioteknologi Farmasi, Sekolah Farmasi ITB. Analisis urutan nukleotida gen tersebut menunjukkan homologi 99,72% dengan gen pengkode protease B. velezensis LPL061 (no. GenBank NZ_CP042271.1/ komplemen 3857304-3858452). Database genom B. velezensis LPL061 di National Center for Biotechnology Information (NCBI) memiliki 17 anotasi gen pengkode serin protease, akan tetapi informasi mengenai aktivitas keratinolitik dari protease-protease tersebut belum tersedia. Data terkait aktivitas keratinolitik dari beberapa B. velezensis hanya berasal dari total protein. Hal ini mendorong dilakukan penelitian lanjutan yang bertujuan untuk mengkarakterisasi akvitivitas keratolitik serin protease dari B. velezensis EC36 dan beberapa karakter lain yang terkait. Gen pengkode serin protease B. velezensis EC36 yang telah berhasil dikloning sebelumnya terdiri dari dua bentuk yaitu gen pengkode KerFull (mengandung domain propeptida dan protein matang) dan KerHalf (domain protein matang tanpa propeptida). Namun, analisis sekuensing DNA terhadap plasmid pET16b rekombinan ditemukan delesi satu basa nukleotida pada kedua gen tersebut menghasilkan kodon stop prematur. Oleh karena itu, penelitian ini diawali dengan perbaikan delesi pada gen pengkode KerFull dan KerHalf melalui mutagenesis terarah dengan menyisipkan satu basa adenin. Plasmid yang membawa gen hasil perbaikan, ditransformasi ke Escherichia coli BL21(DE3) dan dikonfirmasi ukuran serta urutannya. Overproduksi protein dilakukan pada suhu 20?selama 20 jam dengan induksi IPTG 0,05 mM. Pemurnian protein dioptimasi dengan beberapa metode, yaitu metode presipitasi amonium sulfat, kromatografi afinitas Ni-NTA, kromatografi penukar anion dan ultrafiltrasi. Karakterisasi protein meliputi aktivitas proteolitik dan keratinolitik, bobot molekul protein, aktivitas protein pada suhu dan pH optimum, stabilitas protein terhadap suhu dan pH, serta pengaruh inhibitor dan ion logam. Basa adenin pada posisi 1029 dari gen pengkode KerFull dan KerHalf berhasil disisipkan melalui mutagenesis terarah. Hasil deduksi asam amino protein KerFull dan KerHalf identik dengan serin protease Acc. Nr. WP_003155195.1 dari B. velezensis LP061. Produksi protein optimal dicapai pada 20?°C selama 20 jam dengan induksi IPTG 0,05?mM. KerFull yang diproduksi pada suhu 20?°C membentuk zona bening lebih besar pada media agar susu skim dibandingkan produksi pada 37?°C. Analisis SDS PAGE menunjukkan KerFull memberikan dua pita protein dengan ukuran eksperimental 38 kDa (protein fusi) dan 28,5 kDa (protein matang), sedangkan KerHalf menghasilkan pita 32,2 kDa. Ekstrak kasar KerFull (SN) mampu mendegradasi keratin rambut, sedangkan SN KerHalf tidak menunjukkan aktivitas. Temuan ini mengkonfirmasi bahwa propeptida berperan penting dalam proses aktivasi dan pelipatan protein matang. SN KerFull dipilih untuk proses pemurnian dan karakterisasi. Optimasi pemurnian KerFull menggunakan presipitasi amonium sulfat pada saturasi 0-70% tidak berhasil memisahkan protein target. Pemurnian dengan kromatografi penukar anion menghasilkan satu pita sekitar 38,5 kDa pada fraksi elusi NaCl 0,25 mM dalam buffer Tris-Cl 20 mM. Pita tersebut merupakan pita protein fusi dan tidak menunjukkan aktivitas proteolitik ataupun keratinolitik. Pemurnian dengan kromatografi afinitas Ni-NTA tidak berhasil memisahkan protein matang dari protein fusi. Pemurnian protein dengan ultrafiltrasi bertingkat menghasilkan tiga pita protein pada fraksi permeat 50 (P50), salah satunya adalah pita 28,5 kDa (protein matang). Analisis LC-MS/MS mengonfirmasi bahwa pita protein 28,5?kDa pada fraksi P50 memiliki urutan identik dengan serin protease Acc. Nr. WP_003155195.1. Fraksi P50 selanjutnya digunakan untuk karakterisasi protein. Fraksi P50 mampu mendegradasi kasein pada media agar susu skim, keratin rambut dan keratin azure. SN KerFull dan fraksi P50 mendegradasi keratin azure 1% dengan nilai aktivitas spesifik masing masing sebesar 2,41±0,48 U/mg dan 77,1±20 U/mg. Yield aktivitas setelah pemurnian adalah 31,98 %. Fraksi P50 menunjukkan aktivitas optimum pada 60?dan pH 8-9, stabil pada rentang 20-40?dan pH 6-10 dengan aktivitas residual hingga 60% selama 30 menit. Aktivitas enzim relatif tahan terhadap senyawa kimia DTT 5mM, Triton X-100 1% dan ion logam (Ca 2+ , K + , Mg 2+ dan Zn 2+ ) pada konsentrasi 5mM. Aktivitas keratinolitik fraksi P50 dihambat oleh PMSF 5mM. Kombinasi Fraksi P50 dan DTT mampu merusak struktur bulu ayam (yang menjadi model keratin tidak termodifikasi) setelah 2 jam inkubasi pada 50?. Perbandingan dengan literatur menunjukkan bahwa KerA dari B. licheniformis S90, yang banyak digunakan sebagai keratinase komersial memiliki aktivitas spesifik 9,8 U/mg pada 50?dan mempertahan 90% aktivitas selama 30 menit inkubasi. Fraksi P50 memiliki kekuatan 7,9 kali lebih tinggi dibandingkan KerA, dengan karakter biokimia yang relatif serupa. Secara keseluruhan hasil penelitian ini membuktikan bahwa serin protease KerFull yang diklon dari bakteri simbion B. velezensis EC36 dari spons air tawar E. carteri mampu mendegradasi keratin. Serin protease tersebut memiliki memiliki urutan asam amino yang identik dengan serin protease dari B. velezensis LP061 Acc. Nr. WP_003155195.1. Berdasarkan kemiripan karakter aktivitas enzim dengan KerA, maka KerFull berpotensi dikembangkan sebagai alternatif keratinase untuk aplikasi di bidang kosmetik dan farmasi.