Perpustakaan Digital ITB

Ancaman penyebaran patogen infeksius dan agen zoonosis di peternakan ayam terus berlanjut. Di antaranya terdapat infeksi virus HPAI varian endemik H5N1 dan kontaminasi Campylobacter jejuni. Penggunaan antivirus (rimantadine & adamantane) serta vaksin konvensional (non-glycoconjugate) terhadap virus H5N1 dan antibiotik (bakteriosin) terhadap C. jejuni menjadi upaya pengendalian utama. Namun strategi tersebut belum terbukti sukses terlebih dengan adanya limitasi seperti ketiadaan DIVA, penerapan lapangan, dan efisiensi induksi respons imun. Karenanya dibutuhkan pendekatan holistik untuk menjawab tantangan tersebut. Salah satunya melalui pengembangan vaksin subunit berupa glikokonjugat. Platform ini terbukti memberikan fungsi preventif dan proteksi melalui pembentukan antibodi fungsional yang lebih kuat dan bertahan lama terhadap penyakit infeksius. Glikokonjugat dapat diproduksi menggunakan metode baru protein glycan coupling technology (PGCT). PGCT memungkinkan produksi in vivo di Escherichia coli rekombinan yang sistemnya lebih sederhana. Penelitian ini mengembangkan konstruksi plasmid rekombinan untuk produksi dan konjugasi komponen imunogenik utama Hemagglutinin (HA) virus H5N1 dan N-glycan lestari C. jejuni. Ectodomain HA1 dilengkapi HA2 untuk memberikan cross-protection. Penentu virulensi utama MBCS di antara kedua ectodomain dihilangkan untuk mengurangi patogenisitasnya. Strain H5N1 varian endemik Indonesia digunakan sebagai referensi antigen HA. Glikokonjugasi diperantarai enzim oligosaccharyltransferase (OST) dalam glycosylation-competent E. coli pembawa pACYC184:pgl locus. Lokus tersebut mengkodekan N-glycosylation machinery untuk sintesis faktor virulensi utama N-glycan lestari C. jejuni. Penelitian terdiri dari desain konstruksi gen target rHA5-GT pengkode HA dan situs glikosilasi N-glycan C. jejuni, transformasi plasmid rekombinan prHA5-GT, fraksionasi sel, dan uji produksi protein. Konstruksi dilengkapi lima sequon DQNAT teroptimasi di N- & C-terminal untuk memfasilitasi glikosilasi N-glycan C. jejuni. Glikokonjugat yang dirakit di periplasma disekresikan ke media ekstraseluler oleh sinyal peptida YebF. Ekspresi protein dan glikosilasinya selanjutnya dianalisis dengan metode immunoblotting difasilitasi fusi His6-tag. Ekspresi dilangsungkan dalam dua volume kultur menggunakan Terrific Broth diperkaya glukosa 0,2% dan induksi IPTG 250 ?M pada suhu 25-30o C. Pada produksi 10 mL terdeteksi keberadaan glycosylated YebF-rHA5 hanya dari fraksi protein total dan fraksi terlarut. Kehadiran glikokonjugat di fraksi periplasma baru terdeteksi ketika protein diisolasi dari volume produksi 200 mL disertai pemekatan. Bentuk protein glycosylated YebF-rHA5 (~100 kDa) hanya didapatkan dari perlakuan glycosylation-competent E. coli. Sementara itu, non-glycosylated YebF-rHA5 (83,5 kDa) didapatkan baik dari perlakuan maupun kontrol E. coli-based cell-free glycosylation system. Dari penelitian ini diketahui protein YebF-rHA5 ditranslokasikan dan diglikosilasi di periplasma tetapi tidak disekresikan ke medium ekstraseluler. Penelitian selanjutnya dapat mengeksplorasi penggunaan leaky strain E. coli untuk meningkatkan produksi ke ekstraseluler.