Perpustakaan Digital ITB

Ragi R. toruloides berpotensi menjadi alternatif produsen senyawa karotenoid dan oleokimia, dengan kemampuan mengakumulasi single cell oil (SCO) lebih dari 70% berat kering sel. Kemampuan ini dapat dikembangkan melalui biologi sintetik agar dapat digunakan sebagai alternatif produsen karotenoid, PUFA, biofuel, sesquiterpene, dan senyawa golongan lemak lainnya. Rekayasa genetik pada R. toruloides dapat dilakukan dengan berbagai metode. Elektroporasi adalah salah satu metode transformasi sel R. toruloides yang menggunakan kejut listrik untuk membentuk pori-pori pada dinding dan membran sel ragi. Metode ini lebih sederhana dan cepat dibandingkan metode lainnya, namun tetap memiliki efisiensi transformasi yang tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh transforman hasil elektroporasi R. toruloides (strain lokal InaCC) dengan DNA insert plasmid pPICZ, serta mengoptimalkan keberhasilan transformasi dari sisi bentuk insert yang digunakan, yaitu dengan variasi DNA insert sirkular dan linear. Plasmid pPICZ dipilih sebagai DNA insert karena telah terbukti efektif dalam proses transformasi ragi yang dilakukan dalam penelitian-penelitian sebelumnya, termasuk pada genus Rhodotorula. Dalam penelitian ini, dilakukan pembuatan sel elektrokompeten dan DNA insert, elektroporasi, serta seleksi dan konfirmasi transforman. DNA insert merupakan plasmid pPICZ A yang diproduksi dengan E. coli dan diekstraksi dengan metode alkaline lysis. Untuk variasi insert linear, plasmid dilinearisasi dengan enzim restriksi HindIII. Sel elektrokompeten diproduksi dan dielektroporasi dengan plasmid pPICZ pada voltase 600 V, durasi kejut 5 ms, dan kuvet 2 mm. Transforman diseleksi pada media agar YPD dengan Zeocin 200 ppm, lalu diuji stabilitasnya dan dikonfirmasi dengan PCR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat koloni R. toruloides pada plate hasil elektroporasi dengan plasmid pPICZ pada kedua variasi DNA insert, yaitu sebanyak 32 dan 29 koloni untuk variasi insert sirkular dan linear. Efisiensi transformasi variasi pPICZ sirkular dan linear adalah 19.91 CFU/?g DNA dan 16.29 CFU/?g DNA. Dari hasil pengamatan makroskopis, koloni berbentuk bulat dan berwarna merah, didukung dengan pengamatan mikroskopis yang menunjukkan sel yang berbentuk lonjong dan beberapa budding khas ragi R. toruloides. Sebanyak 3 koloni dengan pertumbuhan terbaik dari masing-masing variasi dikonfirmasi lebih lanjut dengan PCR gen 18S rRNA dan PCR fragmen TEF promoter – bleoR. Hasil PCR gen 18S rRNA mengonfirmasi bahwa sel adalah ragi. Sementara itu, hasil PCR TEF promoter – bleoR mengonfirmasi 2 koloni dari variasi insert sirkular, dan 3 koloni dari variasi insert linear merupakan transforman karena memiliki fragmen TEF promoter – bleoR yang ada pada plasmid pPICZ. Berdasarkan hasil konfirmasi dengan PCR tersebut, disimpulkan bahwa elektroporasi pPICZ pada Rhodotorula toruloides strain lokal berhasil dilakukan dengan plasmid linear dan sirkular.