Malaria masih menjadi salah satu penyakit menular yang paling luas penyebarannya secara global. Parasit genus plasmodium pada manusia secara ekslusif ditularkan melalui gigitan nyamuk Anopheles betina. Salah satu cara efektif untuk pengendalian malaria adalah menghindari kontak antara manusia dan vektor seperti penggunaan larvasida, masif kelambu berinsektisida dan Indoor Residual Spraying (IRS). Kabupaten Sumba Barat melakukan IRS pada tahun 2019 di desa Gaura menggunakan Bendiocarb 0,2 gr/m2 yang bekerja sebagai inhibitor asetilkolinesterase (AchE). Adapun paparan insektisida sintetik secara terus menerus dapat memicu terjadinya resistensi pada vektor sehingga pemantauan resistensi insektisida sangatlah penting. Berdasarkan hasil uji pendahuluan pemantauan status resistensi vektor yang dilakukan tahun 2022, uji susceptibility F1 nyamuk uji menunjukkan resisten terhadap bendiocarb 0,1% ditandai dengan adanya 80% kematian nyamuk uji yang kemudian secara molekuler terkonfirmasi adalah Anopheles vagus (OM974188.1). Oleh karena adanya potensi resistensi vektor ini, diperlukan bahan insektisida alternatif yang aman dan mempunyai kemampuan untuk menyebabkan resistensi nyamuk yang rendah. Nanopartikel zinc oxide (ZnO NP) banyak dikembangkan dalam berbagai aplikasi termasuk biomedis melaui metode green syntesis. Daun kelor (Moringa oleifera L) mengandung berbagai senyawa fitokimia dengan berbagai manfaat salah satunya sebagai larvasida dan dapat digunakan sebagai agen pereduksi dan penstabil dalam sintesis ZnO NP. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan biosintesis ZnO NP menggunakan ekstrak daun kelor dan untuk mengetahui aktivitas insektisidanya secara in vivo. Ekstraksi daun M. oleifera menggunakan pelarut etanol 96%. Identifikasi senyawa fitokimia ekstrak daun kelor (EMo) dilakukan secara kualitatif, dan menggunakan GC-MS dan LC-MS. Molecular Docking dilakukan pada 25 senyawa fitokimia EMo dan protein AChE Anopheles gambiae (PDB ID:5x61). ZnO NP disintesis menggunakan M. oleifera (ZnO-NMo) dilanjutkan dengan karakterisasi hasil sintesis dan uji toksisitas akut pada Anopheles maculatus instar III untuk mengetahui nilai LC50 dan nilai LC90. Uji statistik menggunakan uji One-Way ANOVA. Berdasarkan hasil penelitian, uji fitokimia kualitatif EMo menunjukkan adanya kandungan saponin, flavonoid, alkaloid, fenolik, steroid, tanin dan terpenoid, uji GC-MS teridentifikasi 34 senyawa fitokimia volatil sementara pada uji LC-MS teridentifikasi 16 senyawa fitokimia terlarut. Selanjutnya hasil molecular docking didapati 7 senyawa yang memiliki Binding Afinity (BA) berturut-turut lebih tinggi dari kontrol Bendiocarb (-6.7), dan Tamephos (-6,2) yaitu 4-cyanocinnoline (-8,5), luteolin (-8,5), quersetin (-8,5), myricetin (7,7), kaempherol (-7,5), beta-bergamotene (-7,3), phytol (-6,8). Selanjutnya karakterisasi nanopartikel ZnO-NMo menggunakan UV-Vis spectrophotometer menunjukkan panjang gelombang berada pada puncak 365 nm. Berdasarkan hasil uji spektra Fourier Transform Infrared (FTIR) teramati gugus-gugus fungsi senyawa fitokimia EMo yang terlibat dalam sintesis ZnO-NMo. Ukuran partikel yang teramati menggunakan High Resolution Transmission Electron Microscopy (HR-TEM) dan analisa ImageJ adalah 13,2 nm dengan morfologi spherical. Particle Size Analyzer (PSA) menunjukkan ukuran partikel terlarut ZnO-NMo berada pada rentang 40,6 nm ± 4,6 nm, sementara muatan permukaan ZnO-NMo -54,5 mV berdasarkan pengukuran pada Zeta Potential Analyzer (ZPA). Analisis kristalinitas ZnO-NMo pada Spektra X-ray Diffraction (XRD) menggunakan acuan JCPDS No.00-036-14z 51 menunjukkan ZnO-NMo hasil sintesis berbentuk kristal hexagonal wurtzite dengan rata-rata ukuran kristalit 15,6 nm dengan derajat kristalinitas sebesar 61,06%. Hasil probit uji toksisitas pada Anopheles maculatus menunjukkan LC50 24 jam paparan pada EMo sebesar 1.900 ppm sedangkan pada ZnO-NMo 380 ppm. Rerata mortalitas larva nyamuk meningkat seiring dengan pertambahan konsentrasi EMo maupun ZnO-NMo (p<0,05). Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa ekstrak daun kelor (M. oleifera ) dapat digunakan untuk green synthesis ZnO NP dan berpotensi memiliki aktivitas bionanoinsektisida dengan toksisitas kategori tidak berbahaya.