Perpustakaan Digital ITB

Nanopatterning merupakan teknik pembuatan motif nano atau rekayasa substrat berskala nanometer pada permukaan material yang banyak dikembangkan untuk aplikasi rekayasa jaringan. Pengembangan tersebut dilakukan karena microenvironment sel dalam tubuh memiliki fitur skala nano berupa nanotopografi. Rekayasa nanotopografi bertujuan memimik lingkungan in vivo sel yang memanfaatkan prinsip interaksi sel dengan nanopattern pada permukaan substrat. Interaksi yang terjadi menghasilkan respon berupa sinyal geometris dan gaya mekanik yang berpengaruh terhadap perkembangan sel meliputi proses adhesi, migrasi, proliferasi dan diferensiasi. Kedua respon tersebut ditransmisikan sebagai sinyal mekanis dari substrat sampai ke nukleus, menjadi suatu proses molekuler yang secara kolektif dikenal sebagai mekanotransduksi. Human Wharton’s Jelly-derived Mesenchymal Stem Cells (hWJMSCs) merupakan sumber sel yang banyak digunakan dalam studi rekayasa jaringan dengan mengarahkan kemampuan multipotensinya untuk berdiferensiasi menjadi beberapa tipe sel. Ekspresi fenotip sel hWJ-MSCs sangat dipengaruhi melalui modulasi faktor biofisik terhadap microenvironment-nya. Beberapa penelitian membuktikan efek stimulus dari rekayasa nanotopografi sebagai substrat mampu menginduksi proses diferensiasi hMSCs. Studi pada penelitian ini bertujuan menguji efek nanotopografi berbasis nanopattern yang dilapisi maupun tidak dilapisi oleh ekstrak spidroin dari jaring Laba-laba Argiope appensa terhadap attachment, spreading, morfologi, proliferasi dan diferensiasi sel hWJ-MSCs menjadi sel kondrosit. Penelitian dimulai dengan melakukan kultur primer sel hWJ-MSCs yang didapatkan dari donor pasien sectio caesar. Kultur primer sel hWJ-MSCs pada subkultur ke-4 kemudian dianalisis penanda positif dan negatif dengan menggunakan flowcytometry dan kemampuan multipotensinya sesuai dengan persyaratan International Society Cellular Therapy (ISCT). Untuk mengembangkan nanotopografi berbasis nanopattern, digunakan polimer Polydimethylsiloxane (PDMS) sebagai substrat untuk mencetak pola kisi nano yang terdapat pada permukaan cakram optik Bluray (BR-D) berukuran 130-230 nm. Substrat nanopattern PDMS-BD-R diberikan perlakuan plasma treatment dan dilapisi ekstrak spidroin. Karakterisasi pola nano yang terbentuk dianalisis dengan Scanning Electron Microscopy (SEM) dan Atomic Force Microscopy (AFM). Spidroin dikarakterisasi dengan menentukan beberapa parameter seperti viskositas, zeta potensial, raman spectroscopy, sudut kontak dan uji sitotoksisitas (MTT assay). Interaksi sel hWJ-MSCs dengan nanopattern dianalisis dengan SEM pada rentang waktu 48 jam pertama setelah cells seeding. Proliferasi sel hWJ-MSCs yang dikultur di atas nanopattern PDMS-BD-R maupun kontrol, baik yang dilapisi maupun tidak dilapisi spidroin, dianalisis dengan menggunakan pengujian MTT. Sementara itu, proses kondrogenesis dianalisis dengan menentukan ekspresi penanda spesifik seperti kelimpahan matriks Glycosaminoglycan (GAG) menggunakan Alcian Blue Staining dan Imunositokimia Kolagen tipe II dan SOX9 masing-masing pada hari ke-7, 14 dan 21. Berdasarkan hasil penelitian, kultur primer pada subkultur ke-4 sel hWJ-MSCs telah memenuhi persyaratan ISCT dengan morfologi fibroblast-like dan sifat plastic-adherent. Uji multipotensi menunjukkan sel mampu berdiferensiasi menjadi sel adiposit, kondrosit maupun osteosit dan memiliki penanda positif CD90 (96,6%), CD73 (99%), CD105 (91,2%); penanda linn-negatif (0%) untuk CD34, CD45, CD11b, CD19. Karakteristik larutan ekstrak spidroin memiliki nilai viskositas dan zeta potensial masing-masing sebesar 0,896 mPa.s dan -34,8 mV, sedangkan uji sitotoksisitas pada konsentrasi spidroin 50 dan 100 ?g/mL menunjukkan tingkat proliferasi sel hWJ-MSCs >125% yang menandakan spidroin tidak toksik bagi sel. Hasil pengujian sudut kontak spidroin pada substrat PDMS-BD-R+Spidroin sebesar 14,562o serta hasil analisis Raman Spectroscopy menunjukkan terdapat kemungkinan distribusi sekuens RGD pada rentang bilangan gelombang 900-1100 cm-1 dan 1250-1525 cm-1. Fabrikasi nanopattern PDMS-BD-R memiliki ukuran lebar lekukan (nanogroove) 234±8,92 nm, ukuran lebar tonjolan (nanoridge) 145±2,67 nm dan tinggi puncak tonjolan 15±0,782 nm. Proses attachment dan spreading serta morfologi sel hWJ-MSCs yang dikultur pada substrat PDMS-BR-D+Spidroin selama 48 jam menunjukkan jumlah sel yang lebih banyak menjulurkan filopodia dan lamellipodia-nya, sel tumbuh mengikuti alur pattern dan densitas sel yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok sel yang dikultur pada PDMS non-pattern+Spidroin. Hal tersebut sejalan dengan hasil MTT proliferasi bahwa terjadi peningkatan proliferasi sel hWJ-MSCs hingga hari ke-14 pada kelompok sel yang dikultur di atas substrat PDMS-BD-R+Spidroin dengan p-value<0,001, jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Uji kelimpahan matriks menunjukkan kelompok sel yang dikultur pada PDMS-BD-R+Spidroin mengalami peningkatan kelimpahan matriks GAG (p<0,001) jika dibandingkan dengan kelompok kontrol terhitung pada hari ke-14 dan 21. Berdasarkan hasil imunositokimia, Kolagen tipe II dan SOX9 terdeteksi pada hari ke-7, kemudian mengalami peningkatan intensitas fluorescence-nya (hari ke-14 dan 21) dan sel hWJ-MSCs mengalami perubahan bentuk sel yang sebelumnya memanjang dan berjajar (hari ke-7) menjadi bulat dan membentuk agregat nodul kondrosit (hari ke-14 dan 21) pada kelompok sel yang dikultur di atas substrat PDMS-BD-R+Spidroin. Berdasarkan hasil penelitian, dapat disimpulkan bahwa kombinasi nanotopografi dan pelapisan ekstrak spidroin mampu meningkatkan attachment, spreading dan proliferasi sel hWJ-MSCs, mempercepat pembentukan agregat nodul kondrosit, serta mengakselerasi proses diferensiasi sel hWJ-MSCs menjadi sel kondrosit sebagai salah satu metode baru dalam rekayasa jaringan rawan.