Perpustakaan Digital ITB

Penelitian sebelumnya telah menunjukkan kemampuan Dimer-based Screening System (DBSS) sebagai sistem penapisan high-throughput yang menarget protein SARS-CoV-2 yaitu C-terminal domain (CTD) protein nukleokapsid (N). Penapisan ini bergantung pada kompatibilitas struktur senyawa pada sisi dimerisasi protein fusi AraC-CTD N, namun terdapat peluang false positive apabila terjadi interaksi senyawa dengan AraC. Diperlukan metode lain untuk mengkonfirmasi interaksi senyawa dengan protein target antivirus, salah satunya dengan metode chemical cross-linking yang memungkinkan pengamatan interaksi antara senyawa antivirus dan protein target secara langsung. Penelitian ini bertujuan untuk menguji kandidat senyawa antivirus menggunakan pendekatan in silico dan metode DBSS, sekaligus menguji hasil yang diperoleh menggunakan metode chemical cross-linking. Kandidat antivirus yang diujikan adalah curcumin, porphyrin, dan bentuk senyawa carbon-nanodots (curcumin-dots dan porphyrin-dots). Penapisan senyawa secara in silico dilakukan dengan molecular docking menggunakan AutoDock Vina, sedangkan pengujian secara in vitro dilakukan menggunakan sistem DBSS CTD N SARS-CoV-2 yang telah dikembangkan sebelumnya. Senyawa terbaik hasil uji molecular docking dan DBSS dikonfirmasi interaksi dan kemampuan penghambatan dimerisasinya terhadap CTD N SARS-CoV-2 menggunakan metode cross-linking dengan optimasi konsentrasi crosslinker BS3 dan durasi inkubasi. Protein rekombinan diperoleh dari plasmid ekspresi pET23a(+)_CTD N (~3950 bp). Visualisasi hasil cross-link dilakukan menggunakan metode SDS-PAGE dan western blotting. Konfirmasi kemampuan inhibisi dimerisasi senyawa uji dilakukan dengan menambahkan variasi konsentrasi senyawa pada reaksi cross-linking. Hasil in silico menunjukkan senyawa dengan persentase interaksi terhadap residu dimerisasi tertinggi, yaitu curcumin-dots (28.57%), diikuti oleh porphyrin (14.28%) dan curcumin (14.28%). Hasil ini didukung dengan pengujian DBSS yang menunjukkan senyawa dengan kemampuan inhibisi dimerisasi tertinggi (nilai fluoresensi relatif), yaitu curcumin-dots (3417.2 RFU), diikuti oleh porphyrin-dots (2523.1 RFU), curcumin (2377.9 RFU) dan porphyrin (2059.7 RFU). Dari kedua hasil tersebut, curcumindots digunakan sebagai senyawa yang divalidasi lebih lanjut dengan cross-linking. Metode cross-linking terkonfirmasi berhasil menyebabkan dimerisasi protein CTD N SARS-CoV-2 dengan adanya pita protein dimer (~29 kDa) pada penambahan crosslinker BS3 berdasarkan hasil SDS-PAGE dan western blotting. Konfirmasi kemampuan senyawa uji dengan crosslinking menunjukkan bahwa penambahan curcumin-dots (1000, 1500, dan 2000 ?g/mL) pada reaksi cross-link berhasil mengurangi keberadaan protein dimer (~29 kDa) dibandingkan kontrol 0 ?g/mL. Dapat disimpulkan bahwa metode molecular docking dan DBSS berhasil menunjukkan kemampuan penghambatan dimerisasi CTD N SARS-CoV-2 pada seluruh kandidat senyawa antivirus, serta chemical cross-linking berhasil mengkonfirmasi kemampuan curcumin-dots untuk berinteraksi dan menghambat dimerisasi CTD N SARS-CoV-2.