Cartilage Oligomeric Matrix Protein, COMP adalah suatu protein asam pentamerik
non-kolagen yang terdapat pada matriks ekstraseluler dalam tulang rawan.
Kegunaan klinis COMP adalah sebagai biomarker yang digunakan untuk
memantau kemajuan proses pengobatan pada degenerasi tulang rawan terutama
osteotritis (OA). Metode yang sudah dikembangkan untuk deteksi dan kuantifikasi
COMP dari cairan sinovial, darah, dan urin adalah dengan immunoassay (ELISA,
ECLIA dan ELFA). Walaupun kuantifikasi COMP dengan metode ELISA
memiliki sensitivitas yang baik, masih menimbulkan masalah positif palsu yang
tinggi berdampak sulit membedakan kadar COMP pada pasien artritis dan trauma
akut kemudian terjadi ketidakbermaknaan nilai interpretasi pengukuran. Kondisi
lain adalah mahalnya antibodi dan baku standar COMP sebagai antigen serta
memiliki masa simpan yang pendek dan mudah rusak. Dengan demikian, penting
mengembangkan metode alternatif ekstraksi COMP disertai pengembangan metode
analisis COMP yang sederhana seperti spektrofotometri.
Pada awal COMP ditemukan, para peneliti mengekstraksi COMP dari tulang rawan
binatang dan tulang rawan manusia dalam larutan mengandung EDTA atau heparin
dengan yield yang memadai dari sampel yang melimpah. Namun, pada kondisi
ketersediaan sampel yang terbatas seperti darah dan urin adalah tidak
memungkinkan untuk memperoleh yield yang representatif. Diperlukan inovasi
ekstraksi yang mampu mengikat sekaligus memekatkan secara efisien. Upaya
pengikatan sekaligus pemekatan protein kadar rendah pada sampel banyak
dilakukan menggunakan adsorben partikel magnetik. Preparasi partikel magnetit
yang diperkaya EDTA disintesis menggunakan metode elektrokimia secara cepat
dan efisien telah dilaporkan peneliti lain bahwa partikel ini memiliki kristalinitas
yang paling baik saat diproduksi skala kecil. Bila adsorben magnetik diproduksi
dalam skala menengah untuk memperoleh jumlah partikel lebih banyak, maka
diperlukan optimasi metode sintesis partikel magnetik yang diperkaya EDTA
secara elektrokimia.
Pemanfaatan adsorben magnetit yang diperkaya EDTA (magnetit@EDTA) saat
ekstraksi fasa padat protein dalam sampel urin, terbukti dapat memekatkan protein
ii
globular sebanyak 27% dalam waktu cepat termasuk di dalamnya kelompok
metalloprotein. Begitu pun albumin dalam urin turut terikat pada adsorben.
Konsentrasi albumin di dalam urin lebih rendah daripada di dalam darah dan cairan
sinovial, oleh karena itu penting menguji interferensi albumin pada saat ekstraksi
COMP dari sampel cairan biologis. Masalah selanjutnya, karena titik isoelektrik
albumin (pI=4,0) dan protein COMP (pI=4,2) berdekatan akan berpotensi samasama terikat lemah pada partikel magnetit@EDTA pada saat ekstraksi, namun hal
ini akan dapat dipecahkan dengan teknik pemisahan protein berdasarkan berat
molekul.
Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi sintesis magnetit@EDTA sebagai
adsorben pengikat agar memiliki kemurnian fasa magnetit dan kristalinitas baik
dalam skala produksi menengah. Selanjutnya, melakukan studi adsorpsi COMP
murni pada partikel magnetit@EDTA dan menemukan model adsorpsi isoterm
yang paling baik. Proses uji coba aplikasi ekstraksi COMP pada sampel dilakukan
pada tulang, sedangkan untuk menyimulasikan gangguan albumin pada ekstraksi
dan analisis COMP secara spektrofotometri digunakan sampel buatan sebelum
diaplikasikan pada sampel darah dan cairan sinovial.
Sintesis magnetit@EDTA dimulai dengan pengaturan perangkat elektrokimia.
Katoda baja stainless kelas 316L 2B ditempatkan di tengah berjarak 5-7 cm dari
anoda karbon grafit. Katoda ditempatkan di antara dua anoda dalam sebuah bak
berisi cairan elektrolit menggandung disodium EDTA dan besi. Serbuk EDTA lebih
dahulu dilarutkan sebelum besi (rasio Fe (III) dan Fe (II) 1:2), pH 4-7. Catu daya
diatur pada densitas arus 10 mA/menit pada katoda ukuran 8 cm x 5 cm selama 10
– 15 menit pemberian arus listrik 400 mA sampai terbentuk deposit hitam.
Setelah diberikan arus listrik dari catu daya, suhu meningkat lebih dari 25 °C dalam
larutan elektrolit menyebabkan magnetit dan hematit pada katoda menjadi sulit
terdeposit. Upaya mengurangi terbentuknya fasa pengotor hematit dan
memaksimalkan produk utama magnetit, dilakukan pengendalian temperatur
dengan cara menurunkan suhu sampai dibawah 10?, sehingga proses elektrokimia
dilakukan di dalam ruang dingin. Analisis FT-IR magnetit@EDTA menunjukkan
vibrasi kuat untuk gugus karbonil (C=O) pada bilangan gelombang 1625 cm-1
,
polietilen (-CH2) pada bilangan gelombang 2947 cm-1, dan besi oksida (FeO) pada
bilangan gelombang 590 cm-1. Hasil analisis XRD menunjukkan kristalinitas baik
sebesar 68%, kemurnian fasa magnetit 98% dibandingkan pada acuan baku bahan
International Centre for Diffraction Data (ICCD). Ukuran partikel dengan particle
size analyzer menunjukkan ukuran submikron antara 4000 – 10.000 nm. Hasil
analisis SEM, partikel menunjukkan bentuk partikel amorf. Hasil uji histeresis
magnetik skala sedang dan membentuk sigmoid sebagaimana partikel magnetit
pada umumnya.
Studi adsorpsi COMP pada magnetit@EDTA dilakukan pada suhu ruang. Indikator
capaian dilihat dari nilai koefisien regresi yang paling tinggi pada adsorpsi isoterm.
Nilai R2
Freundlich, Temkin, dan Langmuir secara berurutan antara lain 0,992741,
0,957649, dan 0,952107. Proses adsorpsi COMP pada partikel magnetit@EDTA
berjalan maksimal selama 1 jam homogenisasi di dalam larutan penyangga fosfat
iii
pH 7,4 pada suhu 20 – 25 °C. Nilai konstanta Freundlich 0,016391 menjelaskan
bahwa interaksi antara adsorben dan protein adalah adsorpsi multilayer. Fenomena
COMP terikat pada permukaan adsorben secara heterogen menyatakan bahwa
distribusi COMP tak seragam, berlapis-lapis terikat di permukaan adsorben.
Adapun frekuensi penggunaan ulang atau reusability adsorben untuk mengikat
COMP adalah sebanyak 1 kali pakai terhadap sampel.
Hasil unjuk kerja uji gangguan albumin pada sampel buatan (albumin serum dan
COMP) yang ditetapkan dengan metode ELISA. Hasil perolehan kembali COMP
105,8% memenuhi persyaratan mutu Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI)
yaitu 90 – 110%. Analisis COMP pada sampel tulang rawan ditetapkan dengan dua
metode yaitu ELISA sebagai pembanding dan metode spektrofotometri UV sebagai
metode diuji. Unjuk kerja metode spektrofotometri menunjukkan nilai LoB 0,002
ng/ml, nilai LOD dan LOQ berurutan 0,091 ng/ml dan 0,876 ng/ml. Hasil uji
perbandingan dengan metode ELISA menunjukkan nilai koefisien regresi 0,9916
mendekati standar CLSI yaitu koefisien regresi >0,9985.
Sintesis partikel magnetit@EDTA metode elektrokimia berlangsung optimal dalam
temperatur rendah. Adsorben memiliki karakteristik material yang terstandar
industri. Mekanisme adsorpsi isoterm COMP pada magnetit@EDTA menunjukkan
model adsorpsi isoterm Freundlich sehingga protein secara elektrostatik terikat
lemah. Sifat ini tentu saja memudahkan proses desorpsi adsorbat COMP dari
adsorben dengan mengambil alih ikatan elektrostatik oleh larutan ionik yang lebih
kuat seperti NaCl pekat. Pengembangan metode analisis COMP secara
spektrofotometri menunjukkan unjuk kerja kompatibilitas yang memenuhi
persyaratan mutu analitis dari CLSI pada sampel tulang rawan sekalipun albumin
sebagai pengganggu hadir di dalam ekstrak sampel. Di masa datang, adsorben
magnetit@EDTA dapat dimanfaatkan sebagai platform pra perlakuan pemekatan
sampel cepat sebelum analisis kuantitatif spektrofotometri UV atau analisis
kuantitatif COMP dari sampel cairan biologis seperti darah dan cairan sendi.